小核仁RNA在維持人多能干細胞自我更新中的作用及機制.pdf

1、目的：胚胎干細胞(ESC)是多能干細胞中多能性最強的細胞系，具有廣闊的研究以及應用前景。然而由于胚胎干細胞多能性的維持機制復雜，目前尚未明確，使得胚胎干細胞的實際應用受到限制。與之相比，臍帶血間充質(zhì)干細胞(uMSCs)多能性水平相對較低，卻是一類頗受重視的多能性細胞，已成為再生醫(yī)學細胞治療中有前景的候選者。目前，uMSCs在部分疾病治療中的應用已得到FDA批準。但是，一些潛在的問題的存在限制了其應用。眾所周知，臨床應用級uMSCs需要具

2、有高活性，且需要量大，而在體外培養(yǎng)條件下uMSCs擴增代數(shù)有限，一旦超出這個范圍細胞將會出現(xiàn)分化或者老化，細胞的生物學活性顯著降低，在疾病治療中的價值也隨之喪失。因此，保持細胞的自我更新能力，維持其增殖活性，抑制其分化是未來間充質(zhì)干細胞研究的重點，對其臨床應用價值的判定具有重要意義。
　　近期研究證實，小核仁RNA（small noculear RNA，snoRNA）在細胞增殖過程中具有重要作用，這為我們提供了新思路。遺憾的是關于

3、此類功能的研究主要集中在腫瘤細胞增殖中，而有關snoRNA與干細胞調(diào)控之間的相關性卻幾無報道。另外，近年來研究發(fā)現(xiàn)部分特殊snoRNAs經(jīng)切割可生成更小的功能性RNAs，即snoRNAs衍生RNAs（snoRNAs derived RNAs，sdRNAs），這些sdRNAs中部分具有微小RNAs(microRNAs，miRNAs)的特征，可發(fā)揮類似miRNA的作用，這一發(fā)現(xiàn)極大地拓展了snoRNAs的作用機制方式。本組研究的目的在于探究

4、一些特殊snoRNAs及其sdRNAs在干細胞中的自我更新維持中的作用及機制。
　　第一部分 C/Dbox SnoRNA3A(U3)促進hESCs多能性
　　方法:(1)通過高通量測序技術檢測hESC分化前后差異表達的snoRNA。通過Northern Blot鑒定C/Dbox snoRNA3A(SNORD3A, U3)、SNORD58(C/DboxsnoRNA58A)及snoRD69(C/Dbox snoRNA69)的內(nèi)源

5、性表達情況。(2)在hESCs中進行過表達和抑制U3、U3-sd RNA，通過Real-time PCR、AP染色等試驗檢測其對hESCs多能性的影響。(3)通過FISH及核質(zhì)分離實驗檢測U3-sd RNA在hESCs中的分布情況。(4)構建體外切割體系及核質(zhì)分離實驗研究U3具體產(chǎn)生位置(5)構建U3突變體檢測U3-sd RNA的形成規(guī)律。
　　結果:(1)Northern Blot實驗發(fā)現(xiàn)在高通量分析中表達量變化顯著的U3在不同

6、分化程度的細胞系中表達差異不顯著，但其衍生small RNA在不同細胞系內(nèi)的表達量呈現(xiàn)為hESCs＞uMSCs＞293T。(2)U3和U3-sd RNA過表達的hESCs多能性基因表達量均顯著增高，克隆顯著增多，而抑制U3-sd RNA后結果相反(3)FISH與核質(zhì)分離實驗顯示，U3-sd RNA胞核內(nèi)含量顯著低于胞質(zhì)。(4)體外切割后Northern Blot鑒定顯示，hESCs胞質(zhì)與U3共孵育可產(chǎn)生更多U3-sd RNA(5)6組突

7、變體過表達結果顯示，過表達Mut-1、Mut-2組細胞產(chǎn)生克隆數(shù)與對照組無明顯差異。其他四種類型突變體過表達后均可以顯著提高hESCs的克隆形成率
　　結論:U3可以維持甚至提高胚胎干細胞多能性。這一作用主要通過在胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)酶切形成的sdRNA實現(xiàn)。另外，sdRNA的產(chǎn)生主要與snoRNA的二級結構有關。
　　第二部分 H/ACA SnoRNA7A促進huMSCs的自我更新
　　方法:(1)干擾H/ACA snoRNAs

8、核心蛋白DKC1、NOP10后通過Real-time PCR、Western Blot等方法檢測uMSCs多能性及增殖能力的變化。(2)芯片數(shù)據(jù)檢測uMSCs分化前后差異表達的snoRNAs。(3)在uMSCs中進行過表達和抑制SNORA7A通過Real-time PCR、Western Blot、EDU、克隆形成、細胞倍增時間等方法檢測其對uMSCs多能性及增殖能力的影響。(4)構建突變SNORA7A核心蛋白結合位點的過表達載體，通過

9、Real-time PCR、Western Blot、EDU、克隆形成、細胞倍增時間等試驗檢測其對uMSCs多能性及增殖能力的影響。(5)成脂和成骨誘導方法檢測SNORA7A對uMSCs分化的調(diào)控作用。
　　結果:(1)H/ACA box SnoRNA在uMSCs增殖能力以及自我更新能力的維持中發(fā)揮重要作用(2)SNORA7A在調(diào)控uMSCs增殖活性發(fā)揮重要作用(3)過表達SNORA7A可以提高7A的自我更新能力(4)抑制SNOR

10、A7A可顯著抑制uMSCs自我更新能力(5)SNORA7A對uMSCs自我更新的調(diào)控主要通過功能單位snoRNP實現(xiàn)(6)DKC1是SNORA7A發(fā)揮作用的關鍵分子(7)SNORA7A具有抑制uMSCs成脂以及成骨分化的作用
　　結論:內(nèi)源性SNORA7A在uMSCs的增殖以及自我更新過程中發(fā)揮重要作用。該作用主要通過形成snoRNP產(chǎn)生。同時，SNORA7A在uMSCs體外培養(yǎng)狀態(tài)下自我更新能力的維持中起到至關重要的作用