BMP信號(hào)通路在多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向中作用及機(jī)制研究.pdf

1、肥胖的產(chǎn)生是由于脂肪細(xì)胞體積增大和數(shù)目增多。其中,脂肪細(xì)胞數(shù)目增多則是由于脂肪組織中多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向的增多,后者在一定的環(huán)境因素作用下分化為成熟的脂肪細(xì)胞。從多潛能干細(xì)胞發(fā)育成為脂肪細(xì)胞是一個(gè)多步驟的過程,包括多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向、前脂肪細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)抑制及終末分化。以前的研究主要集中于從前脂肪細(xì)胞到成熟脂肪細(xì)胞的過程,對(duì)于如何從干細(xì)胞以及多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向研究甚少。
　　 Tang等研究表明BMP

2、-4促進(jìn)C3H10T1/2多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向,但是其下游機(jī)制并不明確,并且對(duì)于其它在多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向過程發(fā)揮作用的細(xì)胞因子了解很少。在本課題中,我們觀察了BMP家族另一成員BMP-2對(duì)多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向過程的影響,并且重點(diǎn)研究了BMP-2和BMP-4共同參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在促進(jìn)多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向的作用機(jī)制,彌補(bǔ)了這一部分研究的空白。
　　 在研究中,我們發(fā)現(xiàn)BMP-2可促進(jìn)C3H10T1

3、/2多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向,并且按照標(biāo)準(zhǔn)脂肪細(xì)胞分化方案誘導(dǎo)后,已定向的前脂肪細(xì)胞可分化為成熟脂肪細(xì)胞,細(xì)胞由成纖維形態(tài)變?yōu)閳A形,胞漿內(nèi)聚集甘油三酯,脂肪細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)脂肪酸結(jié)合蛋白(422/aP2)表達(dá)。BMP-2因此成為被發(fā)現(xiàn)的除BMP-4以外能夠促進(jìn)多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向的又一重要細(xì)胞因子。
　　 為了進(jìn)一步研究BMP信號(hào)通路在多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向過程中作用機(jī)制,我們觀察了不同類型BMP受體對(duì)多潛能干

4、細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向的作用。首先,我們檢測(cè)了C3H10T1/2多潛能干細(xì)胞內(nèi)各種類型BMP受體mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明C3H10T1/2細(xì)胞表達(dá)BMPR-IA和BMPR-II,而BMPR-IB不表達(dá)。這一結(jié)果暗示了BMP-2或BMP-4可能是通過BMPR-IA發(fā)揮功能。然后,我們構(gòu)建了含有持續(xù)激活BMPR-IA、BMPR-IB和激酶部位缺失的BMPR-IA(可競(jìng)爭(zhēng)抑制BMPR-IA活性)基因的質(zhì)粒,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)將持續(xù)激活的B

5、MPR-IA、BMPR-IB和激酶部位缺失的BMPR-IA基因?qū)?KC3H10T1/2多潛能干細(xì)胞,結(jié)果表明持續(xù)激活BMPR-IA和BMPR-IB的細(xì)胞不需BMP誘導(dǎo),直接經(jīng)MDI誘導(dǎo)后可分化為脂肪細(xì)胞,而激酶部位缺失的BMPR-IA顯著抑制了BMP-2或BMP-4引起的多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向。這一系列結(jié)果證實(shí)了BMP-2和BMP-4促進(jìn)多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向是通過BMPR-IA實(shí)現(xiàn)的。
　　 BMP受體主要可激活兩

6、條重要的信號(hào)通路,即Smad和p38MAPK信號(hào)通路。我們檢測(cè)了BMP-2和BMP-4處理分裂期的C3H10T1/2多潛能干細(xì)胞后下游信號(hào)通路激活情況,Smad和p38MAPK信號(hào)通路均可被BMP-2和BMP-4激活。目前少量文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),BMP還可激活Ras/ERK信號(hào)通路。
　　 為了進(jìn)一步明確BMP在多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向中作用機(jī)制,我們使用特異性化學(xué)抑制劑抑制某些信號(hào)分子活性和/或利用RNA干擾方法下調(diào)特定蛋白質(zhì),觀察

7、了Smad、p38MAPK和ERK信號(hào)通路對(duì)BMP引起的多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向的影響。我們利用RNA干擾手段下調(diào)了C3H10T1/2多潛能干細(xì)胞內(nèi)共介導(dǎo)Smad即Smad4的蛋白水平,從而阻斷磷酸化的調(diào)節(jié)性Smad(R-Smads,Smad1/Smad5/Smad8)與之形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能,達(dá)到阻斷BMP/Smad信號(hào)通路的目的。結(jié)果顯示下調(diào)Smad4蛋白水平能明顯抑制BMP-2或BMP-4引起的多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)

8、胞定向。同時(shí),我們還研究了p38MAPK和ERK信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用。我們分別使用p38MAPK化學(xué)抑制劑SB203580和ERK激酶MEK1的化學(xué)抑制劑PD98059預(yù)先處理C3H10T1/2多潛能干細(xì)胞,再給予細(xì)胞BMP處理,經(jīng)MDI誘導(dǎo)后,我們發(fā)現(xiàn)SB203580明顯抑制多潛能干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化,而PD98059X寸此沒有影響,表明p38MAPK信號(hào)通路參與了BMP引起的多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向,而ERK信號(hào)通路在其中發(fā)

9、揮的作用不是很明顯。為排除藥物副作用,我們合成了p38RNAi,結(jié)果表明p38下調(diào)以后BMP引起的多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向被部分抑制。另外,當(dāng)我們?cè)贑3H10T1/2多潛能干細(xì)胞內(nèi)共同轉(zhuǎn)染了Smad4和p38RNAi時(shí),BMP引起的多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向幾乎被完全抑制。綜合這些數(shù)據(jù),我們得出了以下結(jié)論:BMP-2和BMP-4促進(jìn)C3H10T1/2多潛能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞定向依賴Smad和p38MAPK兩條信號(hào)通路,與ERK信號(hào)