Nanog在胚胎干細胞自我更新中的作用機制研究.pdf

1、胚胎干細胞(embryomc stem eells，ES cells)是一群具有多向分化潛能的細胞，發(fā)育上的全能性賦予其在臨床上廣泛的應用前景。對胚胎干細胞全能性機制的研究是其在臨床上得以應用的前提和基礎。Nanog是2003年新發(fā)現的一個轉錄因子，特異性的表達于全能性細胞中，研究發(fā)現Nanog在胚胎干細胞的全能性維持、早期分化以及成體細胞的去分化過程中起至關重要的作用，但是其具體的作用機制現在仍未闡明。本研究旨在通過研究Nanog的下

2、游靶基因、上游信號轉導通路調控、以及其是否參與成體細胞的去分化過程來闡明Nanog在胚胎干細胞自我更新中的作用機制。 本研究的第一部分旨在研究胚胎干細胞中受Nanog表達調控的相關基因。Nanog作為一個轉錄因子通過調控下游基因的表達來發(fā)揮作用，對這些基因的分析研究能夠更好地了解Nanog在胚胎干細胞中的作用機制。我們采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)的方法特異性的降低胚胎干細胞中Nanog的表達，為了

3、得到有效的干擾片斷，我們設計合成了四個特異性的Nanog干擾片斷以及一個陰性對照片斷。從中篩選得到一個高效的干擾片斷Nanog-siRNA-P1，Westerm-Blot和Rea1-Time PCR分析結果顯示Nanog-siRNA-P1對Nanog表達的抑制效率可達90％。Naaog表達降低后，胚胎干細胞呈現分化特征，并伴隨著細胞增殖能力下降。在用RNA干擾方法沉默Nanog表達24h和48h后，采用表達譜芯片篩選變化基因。我們認為這

4、些差異表達基因為Nanog的相關下游靶基因，對這些基因的進一步研究分析將有助于我們了解Nanog在ES細胞全能性維持中的作用機制。 在本研究的第二部分中，我們觀察了P13K信號轉導通路對胚胎干細胞自我更新能力以及Nanog表達的影響。首先，我們觀察到利用P13K信號通路特異性的抑制劑LY294002特異性地抑制P13K通路的激活后，ES細胞呈現明顯的分化狀態(tài)，Nanog表達下降．為了了解P13K信號通路在ES細胞自我更新中的作用

5、是否是通過調節(jié)Nanog的表達介導的，我們構建了Nanog-GFP融合蛋白表達載體，并轉染ES細胞，G418篩選后得到過表達Nanog的ES細胞(Ex-Nanog-J1)。結果表明Nanog的過表達可以使小鼠的ES細胞在無LIF條件下保持不分化狀態(tài)，并可以減弱由于LY294002所引起的ES細胞分化，但是外源性的Nanog并不能完全逆轉這一分化作用。 本研究的第三部分中我們觀察了Nanog在成體細胞去分化中的作用。大家都知道胚胎

6、干細胞可以在適宜的條件下向三個胚層的各種組織細胞分化，成體細胞也可以通過細胞融合(cell fusion)以及成體細胞核移植(somatic cells nucleartransfer,SCNT)的方法去分化到多能性干細胞階段。Nanog特異性的表達于胚胎干細胞中，并且在胚胎干細胞的多能性維持中也起重要作用，那么，Nanog是否參與成體細胞的去分化過程呢?為了研究Nanog在成體細胞去分化中的作用，我們構建了Nanog-GFP融合蛋白表

7、達載體，并轉染3T3細胞，G418篩選得到表達Nanog的3T3細胞，觀察到外源性Nanog特異性的表達于3T3細胞的細胞核中，這與Nanog在胚胎干細胞中的表達定位相同。繼而我們觀察了表達Nanog的3T3細胞是否向著全能性細胞轉化，鏡下觀察其細胞形態(tài)并沒有顯著的變化，細胞周期檢測Nanog可以提高3T3細胞的S期降低G0/G1期和M期，可以激活Oct4的表達，但是卻未檢測到其它的ES細胞相關基因Sox2、Utfl、Ets2的表達。這

8、些表明Nanog在成體細胞去分化過程中，可能會起一定的作用，但是單純的Nanog過表達并不足以使成體細胞去分化到全能性細胞階段。 通過該項研究我們發(fā)現：Nanog在胚胎干細胞的自我更新過程中起至關重要的作用，作為一個轉錄因子Nanog通過促進全能性相關基因的表達以及抑制分化相關基因的表達來維持ES細胞的不分化狀態(tài)；P13K信號通路參與胚胎干細胞全能性的維持，利用LY294002(P13K通路特異性的抑制劑)抑制P13K通路后誘導