人多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)產(chǎn)生肥大和巨噬細(xì)胞的初期發(fā)育及功能研究.pdf

1、目的:
　　肥大細(xì)胞(Mast cells，MC)和巨噬細(xì)胞(Macrophage，MΦ)是非常重要的免疫細(xì)胞，在機(jī)體固有免疫反應(yīng)中具有舉足輕重的作用。MC和MΦ具有極大的異質(zhì)性。在人類MΦ既有分布于血液中以單核形式存在的狀態(tài)，也有在多種組織和器官中分布的組織駐留型，并根據(jù)分布的形態(tài)和功能具有不同命名;而人類MC根據(jù)顆粒中含有蛋白酶種類不同，分為MCT和MCTc兩類，前者與小鼠黏膜MC相似，后者與小鼠組織相關(guān)MC類似。MΦ和MC表

2、面和內(nèi)體分布多種Toll樣受體（TLRs，一種機(jī)體內(nèi)重要的模式識別受體），可有效識別病原體相關(guān)外源性危險信號(PAMPs)和自身細(xì)胞所釋放的內(nèi)源性危險信號(DAMPs)，在機(jī)體防御中發(fā)揮著重要的作用。
　　在個體發(fā)生的早期階段，血細(xì)胞起源在順序上有著時空分布的不同特征。所有血細(xì)胞均來源于中胚層，最早的造血細(xì)胞起源于卵黃囊;隨后進(jìn)入胚內(nèi)的主動脈-性腺-中腎區(qū)域（AGM區(qū)），在此可產(chǎn)生最初的能夠確認(rèn)的造血干細(xì)胞;最后進(jìn)入胎肝造血，在此

3、含有大量可移植的造血干細(xì)胞。依據(jù)人體造血發(fā)生的時空順序及不同特征，可將其分為原始造血和成體造血。在成體造血，所有功能型血細(xì)胞均來源于骨髓中的造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)。然而，對小鼠胚胎造血發(fā)育的研究顯示，起源于卵黃囊的原始造血以及紅系/髓系祖細(xì)胞(EMP)都可產(chǎn)生MΦ。另外，在小鼠胎肝發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)MC前體高度集中于卵黃囊和胎肝血中,提示MΦ和MC存在一個較強(qiáng)的早期胚性發(fā)育階段。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)

4、生于早期胚性發(fā)育階段的這兩種固有免疫細(xì)胞具有組織偏向特性。由于受倫理道德及法律的限制，在人體中進(jìn)行胚胎造血發(fā)育的研究存在諸多困難，導(dǎo)致對人類早期胚胎造血發(fā)生認(rèn)識的缺失。
　　對造血細(xì)胞發(fā)生學(xué)的研究主要基于小鼠等動物模型。但是動物體內(nèi)的研究數(shù)據(jù)并不能完全指示人體內(nèi)的發(fā)育過程。隨著人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)的成功建系以及人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(human induced pluripo

5、tent stem cells，hiPSCs)的體外重編程獲得，為研究人類早期發(fā)育機(jī)制提供了有效的手段。hESCs和hiPSCs統(tǒng)稱為人多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cells，hPSCs)，具有自我更新、無限增殖及分化形成完整個體的能力，為研究跨胚層細(xì)胞、組織以及所有成體細(xì)胞的發(fā)育，提供了有效的手段。已有大量關(guān)于從hPSCs體外成功分化出三個胚層來源成熟細(xì)胞的報道。基于hPSCs向造血細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究，可

6、很大程度上重現(xiàn)早期人類造血發(fā)生過程，有助于詳盡地解析人類胚胎期造血的發(fā)育模式。
　　為了研究人類早期發(fā)育過程中MC和MΦ的發(fā)育情況，從而更好地模擬體內(nèi)早期發(fā)育，需要在體外建立一種高效地趨于自然發(fā)育過程的培養(yǎng)體系。通過與成體HSCs來源固有免疫細(xì)胞比較，研究了早期造血發(fā)育產(chǎn)生固有免疫細(xì)胞的功能及識別能力。在此，以人固有免疫細(xì)胞初期發(fā)育作為研究方向，重點(diǎn)探索hPSCs體外誘導(dǎo)產(chǎn)生MC和MΦ初期發(fā)育的起源及其功能。
　　方法:

7、r>　　基于hPSCs/AGM-S3共培養(yǎng)體系，建立固有免疫細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。以MC和MΦ為主，分別檢測兩種固有免疫細(xì)胞的形態(tài)、表型特征以及功能，并探索兩種細(xì)胞的起源。具體操作方法如下:
　　1.以小鼠主動脈-性腺-中腎(Aorta-Gonad-Mesonephros，AGM)來源基質(zhì)細(xì)胞系(AGM-S3)，與hPSCs體外共培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量造血干/祖細(xì)胞，進(jìn)一步懸浮培養(yǎng)定向產(chǎn)生MΦ和MC。培養(yǎng)方法分為三步:
　　1)將h

8、PSCs細(xì)胞接種到AGM-S3上進(jìn)行共培養(yǎng)，誘導(dǎo)造血分化發(fā)生，監(jiān)測不同時間點(diǎn)克隆形態(tài)及表型分子表達(dá)變化，
　　2)經(jīng)懸浮培養(yǎng)一周，擴(kuò)增造血干/祖細(xì)胞，
　　3)更換培養(yǎng)基進(jìn)行MC或MΦ定向分化。
　　2.觀察兩種固有免疫細(xì)胞形態(tài)及表型特征
　　1)MC形態(tài)學(xué)特征:麥格氏-吉姆薩(May-Grunwald Giemsa，MGG)、酸性甲苯胺藍(lán)(Acidic toluidine blue)以及阿爾新藍(lán)(Alcian

9、blue)化學(xué)染色觀察細(xì)胞形態(tài);電鏡觀察MC內(nèi)顆粒形態(tài);免疫熒光染色觀察MC中Carboxypeptidase A、Cathepsin-G、Tryptase和Chymase蛋白酶的表達(dá)情況，多色流式檢測技術(shù)分析MC表型分子表達(dá)譜系。
　　2)MΦ形態(tài)學(xué)特征:MGG染色觀察三種來源MΦ形態(tài);多色流式檢測技術(shù)分析三種來源MΦ表型分子表達(dá)譜系。
　　3.檢測兩種固有免疫細(xì)胞功能
　　1)MC功能檢測:酶聯(lián)免疫吸附法檢測IgE

10、、Substance P和Compound48/80刺激下，MC上清及細(xì)胞沉淀中組胺的含量;RT-qPCR方法檢測TLRs表達(dá)。
　　2)MΦ功能檢測:利用RT-qPCR方法檢測不同極化條件下，炎癥因子及TLRs表達(dá);通過低密度脂蛋白(LDL)吞噬實(shí)驗(yàn)檢測MΦ吞噬能力。
　　4.尋找MC的祖細(xì)胞:利用流式分選技術(shù)(Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS)分選目標(biāo)細(xì)胞群，確定MC祖細(xì)胞

11、
　　結(jié)果:
　　1.建立高效的hPSCs/AGM-S3共培養(yǎng)造血細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系，可產(chǎn)生大量高純度MC和初期MΦ。
　　1)共培養(yǎng)14天再向MC定向培養(yǎng)10天，體系中發(fā)現(xiàn)C-KIT+，CD45+，Tryptase+和Chymase+的MC，40天雙陽比例高達(dá)98％。
　　2)共培養(yǎng)3天再向MΦ定向培養(yǎng)14天，可產(chǎn)生初期MΦ。
　　2.產(chǎn)生的兩種固有免疫細(xì)胞具有組織偏向型
　　1)化學(xué)染色，免疫熒光染

12、色，電鏡觀察以及IgE、Substance P和Compound48/80刺激下，MC都可釋放組胺，確定我們的培養(yǎng)體系產(chǎn)生的MC為MCTC類型。
　　2)初期產(chǎn)生MΦ在IL-4刺激可有效極化成M2型
　　3.產(chǎn)生的兩種固有免疫細(xì)胞與成體HSCs來源固有免疫細(xì)胞不同
　　1)以外周血單個核細(xì)胞作為對照，與臍帶血CD34+細(xì)胞來源的MC相比，hESCs/AGM-S3共培養(yǎng)產(chǎn)生的MC高表達(dá)TLR2，TLR4和TLR9。

13、>　　2)與臍帶血CD34+細(xì)胞來源MΦ以及共培養(yǎng)14天來源MΦ相比，共培養(yǎng)3天來源MΦ表型分子具有明顯不同的表達(dá)水平。IL-4刺激共培養(yǎng)3天來源MΦ中TLR1～TLR8基因表達(dá)水平明顯高于前兩種來源MΦ。
　　4.產(chǎn)生的兩種固有免疫細(xì)胞誕生于成體造血干/祖細(xì)胞(CD34+CD45+)之前
　　1)流式分選共培養(yǎng)第8天CD34+C-KIT-和CD34+C-KIT+兩群細(xì)胞，向MC定向培養(yǎng)14天，免疫熒光染色顯示兩亞群產(chǎn)生子代

14、細(xì)胞Tryptase和Chymase雙陽百分比都大于85％。
　　2)共培養(yǎng)第3天產(chǎn)生的MΦ，誕生于成體造血干/祖細(xì)胞之前。
　　結(jié)論:
　　1.hPSCs/AGM-S3造血共培養(yǎng)體系可誘導(dǎo)產(chǎn)生MC和MΦ等固有免疫細(xì)胞，并且在成體造血干/祖細(xì)胞（CD34+CD45+細(xì)胞）誕生之前，可產(chǎn)生一群MC和MΦ。
　　2.這群MC和MΦ具有自己獨(dú)特的發(fā)育途徑。
　　3.這些初期產(chǎn)生的固有免疫細(xì)胞偏向于組織特性，高表達(dá)