SIRT1在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的功能和分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：SIRT1(silent information regulator protein1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)依賴的第三類組蛋白去乙酰化酶，在細(xì)胞分化、凋亡、衰老、腫瘤發(fā)生等眾多生理和病理過程中均起到極其重要的作用。已有的研究表明，SIRT1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，與血管生成密切相關(guān)，但SIRT1在視網(wǎng)膜血管生成中的作用至今尚未明確，有鑒于此，本論文

2、旨在研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞特異性的SIRT1在生理性和病理性視網(wǎng)膜血管生成中的作用，力求闡明其在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的功能與分子機(jī)制。
　　方法：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：通過Cre-LoxP系統(tǒng)構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞條件性敲除SIRT1（SIRT1 conditional knockout，cKO）的小鼠動(dòng)物模型。免疫磁珠法分離小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（mouse retinal endothelial cells，mRECs），細(xì)胞免疫熒光（IF）染色鑒定視網(wǎng)膜血

3、管內(nèi)皮細(xì)胞。通過IF、蛋白免疫印跡（Western blot）、定量PCR檢測(cè)SIRT1在小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。采用視網(wǎng)膜鋪片及免疫熒光方法觀察P5（出生后第5天）以及P8（出生后第8天）小鼠視網(wǎng)膜血管的生成情況；EdU染色觀察視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖情況。通過早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（ROP）小鼠模型研究SIRT1在視網(wǎng)膜病理性血管生成中的作用，免疫熒光方法檢測(cè)P12、P17、P21、P26的小鼠視網(wǎng)膜病理性血管生成情況。細(xì)胞與分子生物學(xué)

4、實(shí)驗(yàn)：體外原代培養(yǎng)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human Retinal Microvascular Endothelial Cells，HRMECs），采用RNA干擾（RNA interfering，RNAi）技術(shù)敲減SIRT1在HRMECs中的表達(dá)；通過慢病毒（Lentivirus， Lv）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)在HRMECs中過表達(dá)SIRT1。Western blot檢測(cè)SIRT1的表達(dá)，MTS方法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞流式技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，

5、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HRMECs的遷移能力，matrigel血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血管形成能力。通過基因芯片篩選出SIRT1 cKOECs中差異表達(dá)的基因，定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的基因。Westernblot檢測(cè)差異基因的蛋白水平變化，免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)蛋白乙?；降母淖儭?br>　　結(jié)果：⑴建立了血管內(nèi)皮細(xì)胞條件性敲除SIRT1（SIRT1 cKO）的小鼠模型，該小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中SIRT1不表達(dá)，外觀上與正常野生型小鼠無明顯差

6、異，可以正常生長(zhǎng)發(fā)育；⑵與對(duì)照組相比，SIRT1 cKO小鼠P5和P8視網(wǎng)膜血管覆蓋面積減少25％，血管密度減少，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移受到抑制；⑶ROP小鼠模型中，SIRT1 cKO小鼠P17、P21視網(wǎng)膜無血管區(qū)面積增大，P21新生血管區(qū)明顯增大，P26仍然存在無血管區(qū)和新生血管，提示視網(wǎng)膜無血管區(qū)血管再生和新生血管修復(fù)明顯延遲；⑷原代分離的SIRT1 cKO小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力減弱，siSIRT1轉(zhuǎn)染的HRMEC細(xì)胞中SIR

7、T1表達(dá)下調(diào)，抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖、血管形成能力；⑸Lv-SIRT1感染的HRMEC細(xì)胞中SIRT1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖、血管形成能力；⑹基因芯片結(jié)果顯示與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移相關(guān)的基因VEGF-a，MMP14和VEGFR2基因在SIRT1 cKO的小鼠EC中表達(dá)下調(diào)明顯。其表達(dá)在siSIRT1-轉(zhuǎn)染的HRMECs中mRNA和蛋白水平都下調(diào)，而在SIRT1過表達(dá)的HRMECs中表達(dá)上調(diào)。在P8和ROP P17的SIR

8、T1cKO小鼠體內(nèi)RECs中該基因的mRNA表達(dá)下降；⑺缺氧條件下在HRMECs中下調(diào)SIRT1表達(dá)，缺氧環(huán)境中重要的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α乙?；缴摺IF-1α乙?；降母淖兛梢杂绊懫滢D(zhuǎn)錄活性，是影響其靶基因VEGF-a和MMP14表達(dá)的可能原因。
　　結(jié)論：研究表明，在小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性敲除SIRT1引起內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖受抑制導(dǎo)致視網(wǎng)膜生理性血管生成滯后，以及ROP小鼠模型中視網(wǎng)膜無血管區(qū)的血管再生和新生血管