視網(wǎng)膜周細(xì)胞對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和緊密連接形成影響的研究.pdf

1、研究背景:新生血管性視網(wǎng)膜病變常見(jiàn)于增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等，是一類危害嚴(yán)重的致盲性眼病，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。 研究目的:1.建立PDGFR-β包被的免疫磁珠原代分離培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的方法，并以PDGFR-β、desmin和α-SMA等免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定周細(xì)胞。2.觀察常氧和缺氧下，周細(xì)胞對(duì)RMECs細(xì)胞增生、移行和管腔形成的影響，3.觀察常氧和缺氧下，周細(xì)胞對(duì)RMECs細(xì)胞中TJs

2、復(fù)合物occludin、ZO-1及actin表達(dá)的影響，及周細(xì)胞衍生的血管生成素1在其中的作用。 方法:1.在傳統(tǒng)的消化法、濾網(wǎng)法和選擇性培養(yǎng)基法的基礎(chǔ)上，采用PDGFR-β包被的免疫磁珠原代分離培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察周細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)方式。臺(tái)盼蘭拒染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，MTT法測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。免疫組化法檢測(cè)周細(xì)胞α-SMA、GFAP和vWF因子抗原表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡熒光抗體雙標(biāo)檢測(cè)周細(xì)胞PDGFR

3、-β和Desmin抗原表達(dá)。免疫組化和免疫熒光法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞vWF因子和CD31抗原表達(dá)。2.采用Millicell小室建立周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞接觸式共培養(yǎng)模型，MTT比色實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)常氧和缺氧下周細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增生的影響。MTT比色實(shí)驗(yàn)和3H-TdR摻入法檢測(cè)常氧和缺氧下周細(xì)胞條件培養(yǎng)液(pericyteconditionedmedium，PCM)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增生的影響。細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察常氧和缺氧下PCM對(duì)內(nèi)

4、皮細(xì)胞移行的影響。利用Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)觀察常氧和缺氧下PCM對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的影響。RT-PCR檢測(cè)常氧和缺氧下共培養(yǎng)模型和PCM對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF受體Flk-1/KDR表達(dá)的作用。3.應(yīng)用免疫熒光染色，觀察常氧和缺氧下PCM及angiopoietin-1抗體對(duì)于RMECs細(xì)胞中occludin、ZO-1、actin蛋白分布的影響。采用Westernblot、RT-PCR方法觀察常氧和缺氧下PCM及angiopoietin

5、-1中和抗體對(duì)RMECs細(xì)胞中occludin、ZO-1、actin蛋白和基因水平的作用。利用Westernblot方法觀察不同劑量angiopoietin-1對(duì)RMECs細(xì)胞表達(dá)occludin蛋白的影響。 結(jié)果:1.①原代周細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，16～20d進(jìn)入融合狀態(tài)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈不規(guī)則的多邊形，胞內(nèi)可見(jiàn)較為濃密的絲狀結(jié)構(gòu)，無(wú)接觸抑制，可重疊生長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)加快，4～7d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10～12d進(jìn)入平臺(tái)期。傳

6、代后細(xì)胞不規(guī)則形及胞內(nèi)細(xì)絲更加明顯。用目鏡網(wǎng)格器計(jì)數(shù)法觀察到混雜細(xì)胞小于2％。臺(tái)盼藍(lán)活力拒染率為92％。②周細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)陽(yáng)性，同時(shí)GFAP蛋白和vWF因子表達(dá)陰性。熒光抗體雙標(biāo)顯示周細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)PDGFR-β及Desmin。③視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈紡垂形、類圓形，融合后呈及Desmin。③視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈多邊形、類圓形，融合后呈特征性的“鋪路石”樣外觀，有明顯的接觸抑制。免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光法顯

7、示微血管內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子和CD31表達(dá)陽(yáng)性。2.①常氧下，MTT法觀察到共培養(yǎng)組較單獨(dú)培養(yǎng)組內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目明顯下降，3d、6d和9d的GIR值分別為9.8％(P＜0.05)、17.8％(P＜0.01)和15.5％(P＜0.05)。缺氧下，共培養(yǎng)組3d、6d和9d時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)較單獨(dú)培養(yǎng)組下降，GIR分別為8.6％(P＜0.05)、10.8％(P＜0.05)和7.5％(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)到共培養(yǎng)組在常氧下(3.6±0.1vs10.5

8、±0.6，P＜0.05)和缺氧下(15.1±0.9vs43.9±0.8，P＜0.01)均能抑制DNA合成期S-期的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目。②常氧和缺氧下，共培養(yǎng)組較單獨(dú)培養(yǎng)組Flk-1/KDRmRNA水平分別下降了45.1％(P＜0.05)和27.7％(P＜0.05)。③MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)常氧下，PCM培養(yǎng)組內(nèi)皮細(xì)胞的A值從4h開(kāi)始低于對(duì)照培養(yǎng)組(P＜0.05)，持續(xù)至24h(P＜0.01)；缺氧下，各時(shí)間點(diǎn)PCM培養(yǎng)組內(nèi)皮細(xì)胞的A值與對(duì)照培養(yǎng)組相比

9、差異均無(wú)顯著性。3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，常氧下，PCM培養(yǎng)組內(nèi)皮細(xì)胞的3H-TdR摻入量自4h起低于對(duì)照培養(yǎng)組(P＜0.01)，持續(xù)至24h(P＜0.05)；缺氧下，PCM培養(yǎng)組3H-TdR摻入量較對(duì)照培養(yǎng)組在各時(shí)間點(diǎn)雖有減低的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。四組3H-TdR摻入量的時(shí)間變化趨勢(shì)一致，基本都在8h達(dá)到高峰，24h回落。④PCM組8h時(shí)出現(xiàn)劃痕間距大于對(duì)照組，常氧下持續(xù)至12h、16h和24h；缺氧下持續(xù)至12h、16h，24h時(shí)

10、作用消失。⑤常氧培養(yǎng)24h后，PCM組RMECs細(xì)胞分支樣結(jié)構(gòu)數(shù)目明顯低于對(duì)照組(36.4％，P＜0.05)；缺氧下，PCM培養(yǎng)組與對(duì)照組RMECs細(xì)胞分支樣結(jié)構(gòu)數(shù)目無(wú)明顯差異。⑥暴露于常氧或缺氧16h，PCM組RMECs的Flk-1mRNA水平分別較相應(yīng)對(duì)照組降低(57.3％，P＜0.05)和(55.3％，P＜0.05)。常氧24h，PCM組Flk-1mRNA含量較對(duì)照組降低(43.0％，P＜0.05)。3.①免疫熒光染色顯示，常氧下

11、，PCM可以增加RMECs細(xì)胞occludin和ZO-1在細(xì)胞邊界處的聚集，形成更加完整的線狀排列。缺氧下細(xì)胞邊界處的occludin和ZO-1表達(dá)明顯減少，細(xì)胞漿內(nèi)二者的著色增加。PCM可以部分逆轉(zhuǎn)缺氧造成的TJs蛋白從胞膜到胞漿的分布變化。常氧下，angiopoietin-1抗體預(yù)處理組中occludin和ZO-1在細(xì)胞邊界處的分布較PCM組減弱，胞漿內(nèi)的分布增多；缺氧下，angiopoietin-1抗體預(yù)處理組細(xì)胞邊界處occlu

12、din和ZO-1的著色較缺氧組稍增強(qiáng)。②缺氧組occludin、ZO-1和actin的蛋白表達(dá)量分別較常氧組下降了36.3％(P＜0.05)、56.4％(P＜0.05)和17.0％(P＜0.05)。常氧下，PCM組occludin和ZO-1的表達(dá)量分別較對(duì)照組增加至154.2％(P＜0.05)和123.1％(P＜0.05)。缺氧下，PCM組occludin的表達(dá)量較缺氧對(duì)照組增加至123.7％(P＜0.05)。常氧下，angiopoie

13、tin-1抗體預(yù)處理組occludin的表達(dá)量較PCM組降低了11.9％(P＜0.05)。③缺氧組occludin和ZO-1的mRNA表達(dá)量分別較常氧組下降43.4％(P＜0.05)和29.3％(P＜0.05)。常氧下，PCM組occludin和ZO-1的mRNA表達(dá)分別較對(duì)照組增加了80.4％(P＜0.05)和75.6％(P＜0.05)；缺氧下，PCM組occludin的表達(dá)量較缺氧對(duì)照組增加了46.2％(P＜0.05)。常氧下和缺氧

14、下，angiopoietin-1抗體預(yù)處理組occludinmRNA的表達(dá)量分別較PCM組降低了19.3％(P＜0.05)和23.4％(P＜0.05)。④Westemblot分析顯示，angiopoietin-1可上調(diào)RMECs中occludin的總蛋白及磷酸化蛋白水平，呈劑量依賴性，400ng/ml時(shí)occludin蛋白表達(dá)量最大。 結(jié)論:1.采用PDGFR-β免疫磁珠法改良了視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的獲取方法，通過(guò)其形態(tài)和生長(zhǎng)方式

15、的觀察，及PDGFR-β、desmin、SMA免疫細(xì)胞化學(xué)特征的鑒定，得到了純度高、活力強(qiáng)、可持續(xù)傳代的周細(xì)胞。2.周細(xì)胞可以接觸或非接觸方式抑制常氧下內(nèi)皮細(xì)胞的增生和以接觸式方式抑制缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增生。周細(xì)胞條件培養(yǎng)液可抑制常氧和缺氧下內(nèi)皮細(xì)胞的移行和常氧下內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成。這些作用部分是通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞受體Flk-1/KDRmRNA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。這一過(guò)程可能參與了周細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜新生血管生成的調(diào)控。3.周細(xì)胞可提高內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連

16、接occludin和ZO-1的蛋白和基因水平的表達(dá)，促進(jìn)二者在細(xì)胞間連接部位的分布，并可部分逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的occludin和ZO-1表達(dá)量下降和分布的胞漿化。這種作用可被angiopoietin-1抗體部分抑制，且angiopoietin-1呈劑量依賴性上調(diào)RMECs細(xì)胞的occludin總蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)。證實(shí)周細(xì)胞可以通過(guò)調(diào)節(jié)緊密連接的表達(dá)和分布來(lái)降低RMECs細(xì)胞的通透性，此作用部分是通過(guò)分泌angiopoietin-1實(shí)現(xiàn)