血管內(nèi)皮細(xì)胞microRNA的表達(dá)譜分析和功能研究.pdf

1、研究背景和目的隨著人類基因組計劃的完成，生命科學(xué)進(jìn)入了后基因組時代。研究表明，編碼蛋白的基因總數(shù)不到3萬個，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于最初預(yù)計的10萬個左右。動植物基因組的非蛋白質(zhì)編碼區(qū)存在大量非編碼RNA基因，約占整個基因組的98％，如此龐大的區(qū)域擔(dān)負(fù)著基因的表達(dá)調(diào)控等重要功能。近年來發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA主要包括小干擾RNA(small interfering RNAs, siRNAs)、微RNA(microRNAs, miRNAs)、重復(fù)關(guān)聯(lián)小RNA

2、(repeat associated small interfering RNAs, rasiRNAs)和piwi 交互RNA(piwi-interacting RNAs, piRNAs)。目前人們對非編碼RNA，尤其是microRNA在心血管、腫瘤、干細(xì)胞等領(lǐng)域的研究取得了長足的進(jìn)步，極大的豐富和拓展了人們對這些重要生命科學(xué)領(lǐng)域的認(rèn)知。本課題旨在選擇血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的microRNA對其進(jìn)行相關(guān)表達(dá)譜分析和功能研究，探尋microR

3、NA可能參與的心血管相關(guān)病理生理過程，進(jìn)一步闡明諸如動脈粥樣硬化、腫瘤血管生成等的發(fā)病機(jī)制，為今后運(yùn)用RNA干擾治療心血管疾病提供新的靶點(diǎn)。
　　 研究方法
　　 提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human UmbilicAlVascular EndotheliAlCell, HUVEC)的總RNA，變性膠富集大小約19-25個核苷酸大小的RNA后在3’和5’端分別連接合適的連接子，經(jīng)過RT-PCR 反應(yīng)擴(kuò)增后進(jìn)行T-A 克隆，重

4、組質(zhì)粒送商業(yè)測序，最終構(gòu)建HUVEC的miRNA文庫。運(yùn)用Northern Blot 檢測文庫中miRNA的表達(dá)譜：15％變性膠分離總RNA，電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，紫外線交聯(lián)后運(yùn)用Γ32p-ATP 標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，然后運(yùn)用X 膠片-80℃顯影。運(yùn)用實(shí)時熒光定量RT-PCR 檢測miRNA在組織和細(xì)胞系中的相對表達(dá)量。將包含miR-126基因的EGFL7的第7個內(nèi)含子連同相鄰的外顯子克隆至pEGFPc1質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)

5、，運(yùn)用PCR和NorthernBlot 檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以確定miR-126的生物來源和成熟機(jī)制。運(yùn)用生物信息學(xué)工具PicTar、TagetScan5.1、miRanda、miRBase 預(yù)測miRNA的靶基因。將預(yù)測靶基因的3’UTR 克隆入Pgl3-control的XbaI 位點(diǎn)構(gòu)建螢光素酶報告基因，與miRNA mimics和對照mimics 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過分析螢光素酶的表達(dá)量以初步篩選這些內(nèi)皮高表達(dá)miRNA的靶基因。進(jìn)一

6、步通過Western Blot在細(xì)胞中確認(rèn)miRNA對其靶基因的調(diào)控關(guān)系。干預(yù)HUVEC中miR-155 或miR-221/222的表達(dá)，血管緊張素(Angiotensin,Ang)II 刺激HUVEC后運(yùn)用BCECF-AM 標(biāo)記的Jurkat T細(xì)胞檢測HUVEC與單個核細(xì)胞的黏附性。采用細(xì)胞劃痕法檢測miRNA對AngII 刺激下HUVEC 遷移的影響。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析：兩組間數(shù)據(jù)比較采用student t 檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用AN

7、OVA 方差分析，P<0.05代表結(jié)果存在統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果
　　 成功建立了HUVEC的microRNA文庫，發(fā)現(xiàn)miR-26a, miR-26b, miR-126, miR-155等在文庫中的克隆數(shù)目相對較多。Northern Blot 結(jié)果確認(rèn)miR-126, miR-155和miR-221在HUVEC中高表達(dá)。其中miR-126在小鼠各器官組織中普遍表達(dá)并且在心臟和肺組織中高表達(dá)，然而在細(xì)胞水平，miR

8、-126 特異表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞而在人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞(Human Coronary Artery Smooth Muscle Cell，HCASMC)以及293T、Hela、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中均無表達(dá)。miR-155, miR-221和miR-222在血管平滑肌細(xì)胞也呈高表達(dá)但在Jurkat T, HEK293和Hela細(xì)胞中表達(dá)豐度很低或檢測不出。
　　 miR-126 前體序列和基因組位置在人、大鼠和小鼠基因組中保守。mi

9、R-126基因位于EGFL7的第7個內(nèi)含子中，Real-Time PCR 顯示EGFL7與miR-126 有著相似的表達(dá)譜。包含miR-126基因的內(nèi)含子在工具細(xì)胞中能夠被識別并剪切修飾形成成熟的具有功能的miR-126，而其宿主基因EGFL7 也能夠拼接形成Mrna，兩者的成熟和表達(dá)互不影響。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果表明，VEGF, RGS3, v-CRK, PIK3R2和EGFL7的3’UTR與miR-126的5’端“種子序列”有較佳的匹

10、配位點(diǎn)。螢光素酶報告基因篩選和Western Blot 結(jié)果顯示，VEGF和PIK3R2是miR-126 共同的靶基因。進(jìn)一步，在MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)miR-126 可以通過對VEGF和PIK3R2的調(diào)控而降低AKT 磷酸化水平。此外，miR-126在乳腺癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)而VEGF, PIK3R2的表達(dá)量以及AKT 磷酸化水平均有明顯升高。
　　 生物信息學(xué)分析表明ETS-1的3’UTR 區(qū)存在多個miR-155和miR-

11、221/222 可能同時調(diào)控的靶點(diǎn)。螢光素酶報告基因和Western Blot 結(jié)果證實(shí)miR-155和miR-221/222能夠同時調(diào)控靶基因ETS-1的表達(dá)。miR-155 還能調(diào)控AngII的1型受體在蛋白水平的表達(dá)。AngII能夠刺激HUVEC上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子ETS-1及其下游基因VCAM1, ICAM1,MCP1和 FLT1Mrna等的表達(dá)，同時還能增強(qiáng)HUVEC與Jurkat T細(xì)胞的粘附作用以及HUVEC的遷移活性。然而在HU

12、VEC中過表達(dá)miR-155 或miR-221/222 并以AngII 刺激后，與對照相比，轉(zhuǎn)錄因子ETS-1及其下游基因VCAM1, MCP1和 FLT1Mrna等的表達(dá)均有不同程度的逆轉(zhuǎn)，ICAM1Mrna 無明顯變化。同時，過表達(dá)miR-155 或miR-221/222的HUVEC對Jurkat T細(xì)胞的粘附作用明顯降低。此外，過表達(dá)miR-155 還能降低AngII 誘導(dǎo)的HUVEC 遷移活性，而miR-221/222 無此作用

13、。研究結(jié)論(1) 成功建立了HUVEC的miRNA文庫，確認(rèn)miR-126在HUVEC特異表達(dá)，miR-155，miR-221/222在HUVEC 高表達(dá)。
　　 (2) miR-126 來源于EGFL7基因的第7個內(nèi)含子并且miR-126與其宿主基因的成熟和修飾互不干擾。VEGF和PIK3R2 均為miR-126的靶基因。在MCF-7細(xì)胞系中，miR-126能夠降低VEGF/PI3K/AKT通路的活性。在乳腺癌組織中，miR-

14、126的表達(dá)降低而VEGF，PIK3R2的表達(dá)以及AKT 磷酸化水平均明顯升高。
　　 (3) ETS-1是miR-155和miR-221/222 共同的靶基因。miR-155 還能夠調(diào)控AT1R基因的表達(dá)。miR-155和miR-221/222 均能通過調(diào)控ETS-1及其下游基因的表達(dá)而減輕AngII 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。同時miR-155 還能夠抑制AngII 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性。
　　 (4) 一個miRN