酪氨酸激酶Src與E3泛素連接酶Trim13在天然免疫應(yīng)答中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、天然免疫(innate immunity)是機(jī)體抗感染的第一道防線，它可以在早期識(shí)別并消滅入侵的病原微生物。機(jī)體通過模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別病原體的病原相關(guān)分子模式（PAMPs）隨后激活相關(guān)信號(hào)通路，最終導(dǎo)致Ⅰ型干擾素(IFN)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α（TNFα）等細(xì)胞因子的分泌，從而起到抵抗病原微生物感染的作用。但是過強(qiáng)的天然免疫應(yīng)答也可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，造成病理性組織損傷。為了確保機(jī)體抵抗入侵的同時(shí)保護(hù)自身組

2、織，天然免疫的調(diào)控顯得至關(guān)重要。磷酸化修飾和泛素化修飾是兩種重要的翻譯后修飾，研究表明他們?cè)跈C(jī)體的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，廣泛的參與免疫應(yīng)答的各個(gè)階段。我們課題組的研究方向主要集中在研究翻譯后修飾對(duì)于天然免疫的調(diào)控作用及相關(guān)分子機(jī)制，我們近三年研究了TANK結(jié)合酶1(TBK1)的磷酸化調(diào)控以及E3泛素連接酶Trim13介導(dǎo)的天然免疫調(diào)節(jié)。
　　TANK結(jié)合激酶1(TBK1)作為抗病毒應(yīng)答中關(guān)鍵的激酶分子，其活性的調(diào)控一

3、直是分子免疫學(xué)研究的重點(diǎn)。然而到目前為止，關(guān)于TBK1活化的調(diào)控卻知之甚少。因此在本論文的第一部分中將重點(diǎn)尋找并探索TBK1活化相關(guān)分子。我們首先從尋找天然免疫過程中TBK1的磷酸化位點(diǎn)出發(fā)，觀察TBK1各個(gè)酪氨酸殘基非活性突變體在抗病毒天然免疫應(yīng)答中的作用，尋找到除Ser172外又一個(gè)對(duì)于TBK1活化十分重要的磷酸化位點(diǎn)——Tyr179。我們通過Western Blot以及ELISA技術(shù)確認(rèn)TBK1的Tyr179的磷酸化對(duì)其Ser17

4、2位自我磷酸化以及隨后Ⅰ型IFN的產(chǎn)生具有重要意義。接下來我們通過質(zhì)譜分析找到能與TBK1復(fù)合物相互作用的酪氨酸激酶——Src。Src激酶為Src家族激酶(SFK)的一員，由一個(gè)N端的SH4結(jié)構(gòu)域、一個(gè)獨(dú)有(unique)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域以及C端的激酶結(jié)構(gòu)域組成。作為一個(gè)非受體酪氨酸激酶，Src可以介導(dǎo)多種底物的酪氨酸磷酸化修飾從而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、存活、粘附以及細(xì)胞能動(dòng)性等多種生命進(jìn)程。為了探索Src激

5、酶在抗病毒應(yīng)答中的作用，我們利用Src抑制劑或構(gòu)建Src缺失細(xì)胞系來抑制Src的活性或表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)Src的缺失可以抑制TBK1-IRF3信號(hào)通路的活化以及Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，但是并不影響NF-κB及MAPK信號(hào)通路。最后我們通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明Src作用于接頭分子TRIF, MAVS，STING調(diào)控的信號(hào)通路而不影響MyD88信號(hào)通路。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)以及GST-融合蛋白，我們發(fā)現(xiàn)Src通過與TRIF, MAVS或STING形成

6、復(fù)合物來間接調(diào)控TBK1的Tyr179磷酸化，最終調(diào)控TBK1-IRF3信號(hào)通路的活化和Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。通過本部分的研究，我們不僅發(fā)現(xiàn)了TBK1活化相關(guān)的又一磷酸化位點(diǎn)——Tyr179，還尋找到調(diào)控該位點(diǎn)磷酸化的酪氨酸激酶——Src。在受到病毒刺激后，Src可以通過與接頭分子TRIF, MAVS或STING形成復(fù)合物來募集TBK1并介導(dǎo)其Tyr179位磷酸化，隨后促進(jìn)TBK1在172位絲氨酸殘基上發(fā)生自我磷酸化及活化，活化的TBK1則

7、進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3并促進(jìn)其入核，最終促進(jìn)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。該研究深化了TBK1-IRF3的活化機(jī)制，揭示了Src在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的重要作用。
　　除了磷酸化，泛素化修飾在天然免疫調(diào)控中也占有重要的地位。作為泛素化修飾過程中的關(guān)鍵分子，E3泛素連接酶也是天然免疫調(diào)控研究的重點(diǎn)對(duì)象。在第二部分的研究中，結(jié)合基因芯片及文獻(xiàn)查閱結(jié)果，我們認(rèn)為Trim家族的E3泛素連接酶Trim13可能參與調(diào)控天然免疫應(yīng)答，因此我們對(duì)其展開了

8、進(jìn)一步研究。目前關(guān)于Trim13在天然免疫中的調(diào)控作用及作用機(jī)制研究尚不完全。為了探索Trim13在天然免疫相關(guān)信號(hào)通路中的作用，我們首先利用Trim13特異性小RNA干擾RAW264.7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Trim13表達(dá)降低抑制VSV病毒誘導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)，而促進(jìn)HSV-1病毒及LPS刺激后IFN-β及IL-6的表達(dá)。相反，在RAW264.7細(xì)胞中過表達(dá)Trim13可以促進(jìn)VSV病毒誘導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)，而抑制HSV-1病毒及LPS刺激

9、后的IFN-β及IL-6的表達(dá)。為了更深入的探索Trim13的天然免疫調(diào)控功能，我們建立了Trim13的基因敲除（Trim13-ko）小鼠，并利用Trim13-ko和野生型(Trim13-wt)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓來源的巨噬細(xì)胞來重復(fù)以上的刺激實(shí)驗(yàn)，得到了與干擾實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)果。這些結(jié)果表明在多種巨噬細(xì)胞中Trim13對(duì)于不同的病原微生物可能發(fā)揮著天然免疫應(yīng)答雙向調(diào)控作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在腹腔注射李斯特菌4小時(shí)后，Trim13-ko小

10、鼠血清中TNFα及IL-6的含量明顯高于Trim13-wt小鼠，而腹腔注射VSV病毒12小時(shí)后，Trim13-ko小鼠血清中TNF-α、IL-6及IFN-β的含量明顯低于Trim13-wt小鼠。因此我們推測(cè)Trim13對(duì)天然免疫過程具有雙向調(diào)節(jié)作用，即他可以正向調(diào)控RNA病毒誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答，而負(fù)向調(diào)控DNA病毒及TLR配體誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)。接下來我們進(jìn)一步研究了Trim13介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控作用。在HEK293T細(xì)胞中，高表達(dá)

11、Trim13能夠明顯抑制TRIF及STING誘導(dǎo)的IFNβ和NF-κB報(bào)告基因的活化，而促進(jìn)RIG-Ⅰ誘導(dǎo)的的IFN-β和NF-κB報(bào)告基因的活化。但是Trim13高表達(dá)對(duì)于MyD88誘導(dǎo)的IFN-β和NF-κB報(bào)告基因的活化無顯著影響。這提示我們Trim13可能參與調(diào)控多條天然免疫相關(guān)信號(hào)通路。Western Blot結(jié)果顯示Trim13過表達(dá)可以降低STING的表達(dá)水平，但是并不影響TRIF, MAVS的表達(dá)水平，這提示我們Trim