殼聚糖酶的分離純化及酶基因在解脂耶氏酵母中的表達(dá).pdf

1、殼寡糖具有許多獨(dú)特的生理活性及功能性質(zhì),如增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抑菌等,在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。殼聚糖酶是專一性降解殼聚糖的水解酶,可用于功能性殼寡糖的制備。本研究的主要目的是構(gòu)建高效表達(dá)殼聚糖酶的工程菌株,以解決目前殼聚糖酶產(chǎn)量低、成本高等問(wèn)題,同時(shí)為殼寡糖的制備提供有效途徑。
　　 Microbacterium sp.是本實(shí)驗(yàn)室已篩選得到的產(chǎn)殼聚糖酶菌株,在此基礎(chǔ)上,本論文報(bào)道了Microbacterium

2、 sp.殼聚糖酶的分離純化、殼聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表達(dá)及重組酶的性質(zhì)等研究。
　　 采用硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephacryl S-100凝膠層析相結(jié)合的方法對(duì)Microbacterium sp.粗酶液進(jìn)行了分離純化,得到電泳純殼聚糖酶B,純化倍數(shù)為9.9,回收率為20.5％。SDS-PAGE凝膠電泳顯示單一條帶,其相對(duì)分子質(zhì)量約為33.8 kDa。酶解產(chǎn)物質(zhì)譜分析表

3、明殼寡糖主要為四糖、五糖,部分二糖及三糖,無(wú)單糖,說(shuō)明此酶為內(nèi)切酶。酶N端氨基酸序列為ETAGTVDLDAPVQKDT。
　　 根據(jù)酶N端測(cè)序結(jié)果及已注冊(cè)殼聚糖酶序列設(shè)計(jì)引物,以Microbacterium sp.基因組為模板擴(kuò)增得到約1000 bp特異性片段,序列分析表明含有完整的殼聚糖酶編碼基因,其開(kāi)放閱讀框?yàn)?01 bp,編碼266個(gè)氨基酸殘基,屬于糖苷水解酶46號(hào)家族。該基因前26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽,其N端推導(dǎo)序列與測(cè)序結(jié)

4、果一致。
　　 殼聚糖酶基因表達(dá)采用解脂耶氏酵母表達(dá)體系。目的基因與表達(dá)載體pINA1317經(jīng)限制性內(nèi)切酶SfiⅠ、KpnⅠ雙酶切后,連接,構(gòu)建重組載體。重組載體.NotⅠ酶切線性化后轉(zhuǎn)化Yarrowia,lipolytica Polh。采用YNB平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。菌落PCR表明目的基因整合入酵母基因組中。轉(zhuǎn)化子接種于PPB培養(yǎng)基(蔗糖2 g,酵母粉0.132 g,氯化銨0.132 g,磷酸二氫鉀0.032 g,無(wú)水硫酸鎂0.

5、0132 g,硫胺素0.0334 mg,溶于100 ml pH7.0100 mM檸檬酸鹽緩沖液),28℃培養(yǎng)120 h,發(fā)酵上清液酶活力可達(dá)10.4 U／ml,是Microbacterium sp.上清液酶活力的3.15倍。
　　 轉(zhuǎn)化子粗酶液經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析得到電泳純重組殼聚糖酶。SDS-PAGE及Western blotting鑒定了重組蛋白的表達(dá),重組酶相對(duì)分子量偏大,為41k

6、Da,可能與酵母表達(dá)體系的糖基化有關(guān)。酶學(xué)性質(zhì)研究表明重組酶最適反應(yīng)溫度45℃,最適反應(yīng)pH為5.6,緩沖體系為0.2 M乙酸鹽緩沖液。重組酶在pH5.0-7.0、25℃以下具有較好的穩(wěn)定性。Na+對(duì)酶活力有一定的促進(jìn)作用；Ag+、Fe3+具有較強(qiáng)的抑制作用,其中Fe3+(5 mM、10 mM)、Ag+(10 mM)完全抑制酶活力。以殼聚糖為底物,重組酶的Km值為0.926 mg／ml,Vmax為6.15 U／ml。酶解產(chǎn)物主要為三糖、