Muts型重組畢赤酵母表達(dá)解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的研究.pdf

1、解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2(YlLip2)具有很高的水解、酯化、轉(zhuǎn)酯活性，在生物柴油的制備、酯合成以及對(duì)映體拆分等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。本文構(gòu)建了YlLip2的Muts表型重組畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)菌株，搖瓶發(fā)酵篩選高產(chǎn)酶重組子，并研究了其搖瓶發(fā)酵條件，成功進(jìn)行了10L發(fā)酵罐的放大，進(jìn)一步探討了混合補(bǔ)料對(duì)產(chǎn)酶的影響。主要研究結(jié)果如下：
　　 （1）將實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的載體pPICZα-lip2，電轉(zhuǎn)化至P.Past

2、oris KM71H中，得到重組菌KM71H/pPICZα-lip2，所得重組子均為Muts表型。
　　 （2）重組子經(jīng)YPDS平板初篩后，轉(zhuǎn)移至羅丹明B平板定性篩選，最后用搖瓶發(fā)酵定量篩選高脂肪酶活力的重組子，得到一株最高酶活力達(dá)1,080U/mL的25＃重組子。對(duì)25＃重組子進(jìn)行了發(fā)酵條件研究，包括甲醇濃度、pH、誘導(dǎo)時(shí)間、裝液量、接種量；并初步研究了混合補(bǔ)料的影響，探討了其可行性。
　　 （3）進(jìn)行了10L發(fā)酵罐高

3、密度發(fā)酵，并與Mut+表型的發(fā)酵條件進(jìn)行了對(duì)比。Muts表型在發(fā)酵過(guò)程中，其參數(shù)變化較為穩(wěn)定。在單獨(dú)甲醇補(bǔ)加的發(fā)酵過(guò)程中，其最高酶活力達(dá)12,000U/mL，蛋白質(zhì)含量達(dá)2.551g/L。分別研究了甲醇與甘油、山梨醇和乳酸混合補(bǔ)料對(duì)YlLip2生產(chǎn)的影響，甲醇與其它碳源的比例為2:1。其中，甲醇與山梨醇混合補(bǔ)料結(jié)果最好，酶活力最高達(dá)19,800U/mL。之后又研究了甲醇與山梨醇的混合比例對(duì)YlLip2生產(chǎn)的影響，其中甲醇與山梨醇以1:1