解脂耶氏酵母脂肪酶家族的研究及新型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、解脂耶氏酵母是一種非常規(guī)酵母,被認(rèn)為是GRAS(generally regarded as safe),其自身能利用眾多廉價(jià)底物而分泌多種具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的代謝物,故從二十世紀(jì)六十年代后期就開始廣泛應(yīng)用于多種不同的工業(yè)領(lǐng)域。其蛋白表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢(shì):外源基因易于整合到酵母基因組、外源蛋白表達(dá)量高、所表達(dá)的蛋白質(zhì)能進(jìn)行翻譯后加工、重組菌可進(jìn)行高密度發(fā)酵,以及所表達(dá)蛋白質(zhì)的低糖基化等。該酵母在分類學(xué)和分子生物學(xué)上的獨(dú)特性質(zhì)及其表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)

2、勢(shì)使其成為最具研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力的酵母之一,但其基礎(chǔ)性研究的欠缺和現(xiàn)有蛋白表達(dá)系統(tǒng)的不完善性阻礙了其進(jìn)一步應(yīng)用。解脂耶氏酵母脂肪酶家族的特異性是它的眾多獨(dú)特性質(zhì)之一,針對(duì)該家族的系統(tǒng)性研究為闡明其獨(dú)特的分類學(xué)地位奠定基礎(chǔ)。此外,對(duì)現(xiàn)有解脂耶氏酵母表達(dá)系統(tǒng)的改進(jìn)能使其更廣泛的應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所馬延和研究員處獲贈(zèng)一株解脂耶氏酵母菌株CGMCC2.1405,從其中克隆得到其脂肪酶Lip1,Lip3,

3、Lip4及Lip5的cDNA序列,將它們進(jìn)行表達(dá)后分別開展了酶學(xué)性質(zhì)研究,并證實(shí)Lip1和Lip3為酯酶而非脂肪酶,修正了人們對(duì)該脂肪酶家族成員的認(rèn)識(shí)。為尋找該酵母脂肪酶新基因,本文利用生物信息學(xué)分析了解脂耶氏酵母基因組中可能的脂肪酶基因,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建小型基因庫(kù),最終采用功能篩選獲得一個(gè)脂肪酶新基因(lip9),進(jìn)行表達(dá)后對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。同時(shí)成功建立了基因克隆新方法。本文構(gòu)建了解脂耶氏酵母蛋白質(zhì)定位載體用于研究其脂肪

4、酶的定位,研究發(fā)現(xiàn),除Lip8為細(xì)胞壁結(jié)合脂肪酶外(Lip2之前已證實(shí)為胞外酶),其它均定位于胞內(nèi)行使某種功能。本論文還構(gòu)建了能利用蔗糖和酪氨酸酶作為篩選標(biāo)記,且能直接應(yīng)用于野生型解脂耶氏酵母株的兩種新型蛋白表達(dá)系統(tǒng),結(jié)果證實(shí)兩種質(zhì)粒穩(wěn)定性好,且能用于高等真核生物蛋白質(zhì)的表達(dá)。此外,上述兩種表達(dá)系統(tǒng)為消除環(huán)境污染、擴(kuò)展解脂耶氏酵母在工業(yè)上的應(yīng)用范圍奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。本論文的主要工作及創(chuàng)新點(diǎn)如下:
　　(1)利用反轉(zhuǎn)錄PCR克隆了脂肪

5、酶Lip1,Lip3,Lip4,Lip5的cDNA序列,將其在畢赤酵母中成功進(jìn)行了活性表達(dá),經(jīng)Ni-NTA層析柱純化后得到單一蛋白并研究了它們的酶學(xué)性質(zhì),首次從功能上證實(shí)Lip4,Lip5為脂肪酶,Lip1,Lip3為羧酸酯酶。
　　(2)根據(jù)已經(jīng)測(cè)得的解脂耶氏酵母基因組序列,利用生物信息學(xué)的方法,預(yù)測(cè)并擴(kuò)增到18個(gè)可能的脂肪酶基因序列,用SignalP3.0對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析后,在大腸桿菌表達(dá)載體 pET-28a(+)中進(jìn)行誘

6、導(dǎo)表達(dá),利用對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯篩選得到一脂肪酶新基因,為更深入驗(yàn)證其脂肪酶功能并研究其酶學(xué)性質(zhì),將其克隆入畢赤酵母中表達(dá),經(jīng)過Ni-NTA柱純化后研究表明,其偏好水解長(zhǎng)鏈酯,具有水解橄欖油的活性,進(jìn)一步證實(shí)其有脂肪酶活性,將其定名為 Lip9。同時(shí)建立了基因克隆的新方法。
　　(3)擴(kuò)增得到釀酒酵母蔗糖基因suc2做為營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記,構(gòu)建得到解脂耶氏酵母新的胞內(nèi)和胞外表達(dá)載體 pINA1297-a-TS和pINA1297-TS

7、,通過比較證實(shí)了同源啟動(dòng)子pTEF更適合于工業(yè)應(yīng)用。同時(shí)利用該表達(dá)系統(tǒng)將人源基因rho進(jìn)行了成功表達(dá)。
　　(4)在構(gòu)建的新表達(dá)載體 pINA1297-a-TS的基礎(chǔ)上,利用增強(qiáng)型熒光蛋白EGFP構(gòu)建解脂耶氏酵母蛋白質(zhì)定位載體,首次對(duì)解脂耶氏酵母脂肪酶成員進(jìn)行定位研究。研究表明,除Lip8外其余均定位于細(xì)胞中,Lip8結(jié)合于細(xì)胞壁上,經(jīng)緩沖液洗10次后熒光湮滅,證實(shí)Lip8是非共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞壁。
　　(5)本文首次將編碼酪氨