釀酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的發(fā)酵工藝研究.pdf

1、脂肪酶(EC3.1.1.3)是一種酯鍵水解酶，能將長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯水解成長(zhǎng)鏈脂肪酸和甘油。脂肪酶廣泛應(yīng)用于生物能源、食品加工等領(lǐng)域。近年來(lái)，由于能源危機(jī)促使人們更關(guān)注生物能源的開發(fā)，生物柴油是理想的生物能源品種，盡管化學(xué)法制備工藝已工業(yè)化，但存在產(chǎn)品分離困難、能耗高及“二次”污染等缺點(diǎn)。酶法制備生物柴油工藝則能克服上述不足，是今后生物柴油制備工藝的發(fā)展方向。游離脂肪酶穩(wěn)定性差，催化過(guò)程中易失活，且不能重復(fù)回收利用，造成生產(chǎn)成本高，制約著

2、其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。全細(xì)胞催化劑可改善穩(wěn)定性、催化活性和回收使用性。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，對(duì)釀酒酵母細(xì)胞表面展示解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）脂肪酶Lip2的發(fā)酵條件進(jìn)行系統(tǒng)研究與優(yōu)化。主要結(jié)果如下：
　　1.研究表面展示Y. lipolytica脂肪酶Lip2基本酶學(xué)特性。比較反應(yīng)溫度、pH、和底物對(duì)表面展示的Y. lipolytica脂肪酶Lip2酶活的影響。結(jié)果表明，表面展示的Y. lipolytica脂

3、肪酶Lip2的最適溫度為40℃，最適pH為8.0，最適底物為C8。
　　2.研究釀酒酵母細(xì)胞表面展示Y. lipolytica脂肪酶Lip2的發(fā)酵工藝參數(shù)的單因素試驗(yàn)?？疾鞊u床轉(zhuǎn)速、裝液量、誘導(dǎo)時(shí)間、半乳糖含量、YNB含量、接種量、誘導(dǎo)溫度、氮源等因素對(duì)展示酶LIP2發(fā)酵生產(chǎn)的影響。實(shí)驗(yàn)表明，在研究范圍內(nèi)，最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：裝液量40 mL，誘導(dǎo)時(shí)間72 h，誘導(dǎo)溫度20℃，半乳糖含量1.5％（w/v），接種量4％，最佳氮源為Y

4、NB。
　　3.在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化上述工藝參數(shù)，酶活可進(jìn)一步增大。首先，采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)7個(gè)影響表面展示脂肪酶酶活的可能因素進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酸水解酪蛋白（Casein acid hydrolysate，CAA）和半乳糖是2個(gè)影響表面展示脂肪酶酶活的主效因子。然后，以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，逼近主效因子的最大產(chǎn)酶區(qū)域。共進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最大產(chǎn)酶區(qū)在第4次實(shí)驗(yàn)（RUN4）附近

5、。最后，采用響應(yīng)面分析法確定顯著因子的最優(yōu)水平。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：5.40 g Na2HPO4，7.45 g NaH2PO4，15.029 g CAA，加水至800 mL，pH7.0，0.1 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min，冷卻后加13.4％（w/v）YNB溶液100 mL，13.821％（w/v）半乳糖溶液100 mL。最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件為：接種量為液體培養(yǎng)基體積的10％；初始pH為7.0；轉(zhuǎn)速為150 r/min；裝液量為