β-甘露聚糖酶基因克隆及在畢赤酵母中的高效表達(dá).pdf

1、本研究通過(guò)基因工程方法克隆Bacillus sp.QYW-1β-甘露聚糖酶目標(biāo)基因，并通過(guò)外源載體的高效表達(dá)獲得大量目的蛋白，消除了代謝調(diào)控機(jī)制對(duì)β-甘露聚糖酶基因的影響，獲得穩(wěn)定的工程菌，酶蛋白產(chǎn)量顯著提高，酶活相對(duì)增加，為β-甘露聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了研究基礎(chǔ)。通過(guò)平板篩選，采用剛果紅染色法從魔芋地土壤中篩選出7株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的優(yōu)良菌株，DNS法測(cè)定酶活，篩選出酶活最高的一株菌作為出發(fā)菌株；綜合形態(tài)觀察、生理生化性質(zhì)鑒定及16

2、S rRNA序列相似性結(jié)果表明為一株芽孢桿菌，實(shí)驗(yàn)室命名為Bacillus sp.QYW-1（GenBank登錄號(hào)JX524224）。根據(jù)16SrRNA序列比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)引物，采用 PCR擴(kuò)增技術(shù)，以Bacillus sp.QYW-1基因組DNA為模板，克隆獲得一段1084bp的β-甘露聚糖酶基因manW（GenBank登錄號(hào) JX869490），軟件分析表明：其編碼360個(gè)氨基酸，分子量為40kDa，屬于糖苷水解酶家族26；Signa

3、lP4.0軟件分析該序列含有一段25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，將優(yōu)化設(shè)計(jì)的Bacillus sp.QYW-1β-甘露聚糖酶的成熟肽編碼序列插入Pichia pastoris表達(dá)栽體pPIC9K中，并位于α-因子信號(hào)肽序列的下游，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-manW；Sac I酶切線性化，電轉(zhuǎn)化Pichia pastoris菌株GS115中。經(jīng)MM和MD平板篩選及PCR鑒定，獲得高效表達(dá)β-甘露聚糖酶的畢赤酵母重組茵株MANW1。重組菌穩(wěn)定性試驗(yàn)表