耶氏解酯酵母脂肪酶基因lipY2的高效異源表達(dá)及分子改造.pdf

1、脂肪酶是一類可催化甘油三酯水解生成甘油及長鏈脂肪酸的水解酶。來源于耶氏解酯酵母的胞外脂肪酶LipY2，由于其在較低pH下仍具有較高的穩(wěn)定性且活性不受膽鹽的抑制，因此可作為口服類替代藥物治療胰腺炎引起的胰酶分泌不足等疾病。然而該酶在口服過程中，常因其易被胰蛋白酶降解而降低療效。故本研究擬通過蛋白質(zhì)工程手段對LipY2進(jìn)行分子改造，以提高其對胰蛋白酶的抗性。
　　本研究將肪酶基因lipY2克隆至分泌型質(zhì)粒pPIC9K上，并在畢赤酵母G

2、S115中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。搖瓶發(fā)酵條件下，甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)60 h后重組脂肪酶LipY2的表達(dá)量最高達(dá)到1033 U/mL。同時根據(jù)脂肪酶LipY2的胰蛋白酶酶解質(zhì)譜分析以及脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)分析，通過多序列比對確定了LipY2中易被胰蛋白酶降解的位點(diǎn)。并針對這些位點(diǎn)，對lipY2基因進(jìn)行了定點(diǎn)改造，構(gòu)建了7個突變體，分別為M36、M63、M215以及組合突變體M36-63、M36-215、M63-215和M36-63-215。
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3、別研究了不同位點(diǎn)的改變，對LipY2的酶活、抗胰蛋白酶水解穩(wěn)定性及酸穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)的影響，結(jié)果如下:與LipY2相比，M36（突變位點(diǎn)為K36、K39）的最適pH下降了一個單位，在相同濃度胰蛋白酶處理下的半衰期提高了8.1％; M63（突變位點(diǎn)為R63）的最適pH也下降了一個單位，在相同濃度胰蛋白酶處理下的半衰期提高了16.6％; M36-63（突變位點(diǎn)為K36、K39、R63）最適pH同樣下降了一個單位，在相同濃度胰蛋白酶處理下的半

4、衰期提高了22.3％。突變體M36、M63和M36-63的酶活力與LipY2基本相同，但在較低pH1～3范圍內(nèi)的穩(wěn)定性以及對胰蛋白酶的抗性都有所提高，尤其以M36-63的效果最為顯著。而M215(突變位點(diǎn)為K215、K218、R220)及M36-215（突變位點(diǎn)為K36、K39、K215、K218、R220）、M63-215突變位點(diǎn)為(R63、K215、K218、R220)和M36-63-215(突變位點(diǎn)為K36、K39、R63、K21