黑曲霉木聚糖酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、木聚糖廣泛存在于植物細(xì)胞壁中，是自然界中含量僅次于纖維素的可再生生物資源。木聚糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，降解木聚糖酶需要多種水解酶的共同參與，其中木聚糖酶是降解木聚糖最關(guān)鍵的酶類，它能夠作用于木聚糖分子中的β-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生不同長度的木寡糖和少量的木糖，從而生成可以再次利用的小分子物質(zhì)。為了利用豐富的木聚糖資源，就必須獲得性質(zhì)優(yōu)良的木聚糖酶。
　　 本文以黑曲霉（Aspergillus，niger）F19來源的野生型木聚糖酶基因xylB

2、和突變的木聚糖酶基因ST7（ser33和Thr186替換為為Cys，以此來引入1個(gè)二硫鍵，同時(shí)將酶表面的Ser39、Ser54、Thr101、Thr105和Thr151替換為Arg）為研究對象，研究了xylB和ST7基因在畢赤酵母中的表達(dá)、重組木聚糖酶的純化及其酶學(xué)性質(zhì)，探索了突變體酶對熱穩(wěn)定性的影響，并對突變體木聚糖酶重組畢赤酵母的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究。主要結(jié)論如下：
　　 1．野生型木聚糖酶基因xylB和突變體木聚糖酶基因

3、ST7在畢赤酵母中的表達(dá)
　　 將木聚糖酶基因xylB和ST7克隆至畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K，重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，經(jīng)過甲醇誘導(dǎo)，木聚糖酶基因都獲得特異性表達(dá)，而且木聚糖酶能夠分泌到培養(yǎng)基中，篩選到兩株高酶活性的重組畢赤酵母，野生型和突變體木聚糖酶重組畢赤酵母的酶活性分別達(dá)到82.9 U/ml和390.2 U/ml。
　　 2．野生型木聚糖酶和突變體木聚糖酶的純化
　　 利用黑曲霉木聚糖酶可以與

4、木聚糖進(jìn)行特異性結(jié)合的特性，對木聚糖酶進(jìn)行分離純化，純化的木聚糖酶在SDS-PAGE上均呈現(xiàn)出單一的蛋白條帶，表明木聚糖酶得到純化。
　　 3．野生型木聚糖酶和突變體木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
　　 與野生型木聚糖酶相比，突變體木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度從45℃提高到50℃，50℃時(shí)酶的半衰期從小于10 min提高到120 min，而且酶反應(yīng)過程中生成物積累量的幅度從36.9％提高到276.3％，酶的熱穩(wěn)定性有了較大的提高。突變

5、體木聚糖酶的比酶活性從2127.9±83.9 U/mg提高到3330.9±173.4 U/mg，Km值從56.9 mg/ml降低到37.2 mg/ml，酶與底物的親和性有較大提高。但Vmax從82.9 mmol/ml．min．mg降低至27.0 mmol/ml．min．mg。
　　 4．突變體木聚糖酶重組酵母誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
　　 采用四因素三水平的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究了甲醇加入量、起始細(xì)胞濃度、pH和誘導(dǎo)時(shí)間四個(gè)因素對重組酵