GPR126對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化和成骨分化的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　青少年特發(fā)性脊柱側(cè)彎對(duì)青少年的身心造成嚴(yán)重的影響，研究其病因，探索早期診斷和新型治療手段成為研究重點(diǎn)。GPR126在機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在近年的全基因組關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)GPR126上的單核苷酸多態(tài)性與青少年特發(fā)性脊柱側(cè)彎具有相關(guān)性，且相同位點(diǎn)的多態(tài)性還與軀體長(zhǎng)度相關(guān)，因此GPR126對(duì)骨骼系統(tǒng)發(fā)育的影響受到了研究者的關(guān)注。目前的研究發(fā)現(xiàn)GPR126參與軟骨發(fā)育的過程，并對(duì)骨形成也有影響。研究顯示GPR126

2、在其他系統(tǒng)的發(fā)育中具有影響細(xì)胞—細(xì)胞間接觸和電耦合的作用，而其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)又使GPR126能與鄰近細(xì)胞、分子、細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生相互作用，甚至遠(yuǎn)處細(xì)胞也可與GPR126被酶解的N端片段(NTF)發(fā)生相互作用，而間充質(zhì)干細(xì)胞聚集是體內(nèi)和體外成軟骨必須的起始階段，且對(duì)成骨也有一定的影響。因此GPR126對(duì)細(xì)胞間黏附或相互作用的影響可能是它調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨、成骨分化的機(jī)制。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有一般間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、可多向分化的特點(diǎn)，且采集

3、過程無創(chuàng)傷、細(xì)胞活力佳、病毒感染率低、不易老化、多次傳代表型不易變化、獲取細(xì)胞量多等優(yōu)點(diǎn)，因此在近些年被認(rèn)為是獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)良來源。
　　目的：
　　此次研究通過慢病毒侵染構(gòu)建GPR126敲低的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞株，并按照標(biāo)準(zhǔn)的流程進(jìn)行成骨和成軟骨實(shí)驗(yàn)，以茜素紅染色、阿爾新藍(lán)染色、熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)、Western-blot觀察對(duì)照細(xì)胞和GPR126敲低細(xì)胞間成骨、成軟骨的差異，探索GPR126對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞

4、成軟骨、成骨影響的具體分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、無菌條件下獲取近胎兒端10cm臍帶組織，去除臍帶動(dòng)靜脈后將臍帶切成1mm3左右小塊進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。分離的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)成骨、成軟骨、成脂分化。
　　2、合成敲低shRNA序列，與慢病毒載體酶切連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌并送菌液測(cè)序。選取陽性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞后獲得病毒上清，以病毒上清侵染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，流式分選后繼續(xù)培養(yǎng)，以熒光定量PCR和Weste

5、rn-blot檢測(cè)鑒定敲低效果。
　　3、將對(duì)照細(xì)胞和GPR126敲低細(xì)胞分別進(jìn)行成軟骨、成骨誘導(dǎo)分化，阿爾新藍(lán)染色、免疫組織化學(xué)檢測(cè)CollagenⅡ和Aggrecan觀察成軟骨效果，茜素紅染色、Western-blot檢測(cè)堿性磷酸酶和骨鈣素觀察成骨效果。
　　4、熒光定量PCR檢測(cè)成軟骨團(tuán)、成骨分化細(xì)胞中GPR126和黏附相關(guān)成員的mRNA表達(dá)變化，并以免疫組織化學(xué)和Western-blot檢測(cè)驗(yàn)證蛋白表達(dá)水平的變化。<

6、br>　　結(jié)果：
　　1、本次實(shí)驗(yàn)中獲得的長(zhǎng)梭形細(xì)胞可貼壁生長(zhǎng)、增殖能力強(qiáng)，符合一般的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及培養(yǎng)特性，且分化實(shí)驗(yàn)也證明其具有成骨、成軟骨、成脂分化潛能，可認(rèn)為該細(xì)胞就是間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、病毒侵染分選培養(yǎng)后，熒光率可達(dá)80％以上，熒光定量PCR顯示GPR126-shRNA1和GPR126-shRNA2細(xì)胞株的GPR126 mRNA表達(dá)水平顯著低于GPR126-CON細(xì)胞株;提取膜蛋白進(jìn)行Western-blo

7、t檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)GPR126-shRNA1和GPR126-shRNA2細(xì)胞株的GPR126蛋白表達(dá)水平顯著低于GPR126-CON細(xì)胞株。說明侵染的GPR126敲低病毒確實(shí)有敲低效果。
　　3、GPR126-CON細(xì)胞形成的軟骨團(tuán)較疏松，而GPR126-shRNA1、GPR126-shRNA2形成的軟骨團(tuán)較致密。CollagenⅡ和Aggrecan在GPR126-shRNA1、GPR126-shRNA2細(xì)胞分化的軟骨團(tuán)中高表達(dá)。GPR

8、126-CON細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞后，鈣結(jié)節(jié)紅染，均勻分布在視野中，而GPR126-shRNA1、GPR126-shRNA2細(xì)胞成骨在成骨分化過程中有互相聚集的趨勢(shì)，形成“小島”狀鈣結(jié)節(jié)集合，在更高倍顯微鏡下可觀察到鈣結(jié)節(jié)密集的情況。成骨分化過程中對(duì)照組堿性磷酸酶和骨鈣素表達(dá)水平高于敲低組。
　　4、對(duì)照組和敲低組間充質(zhì)干細(xì)胞在成軟骨過程中GPR126均有升高，對(duì)照組GPR126mRNA上調(diào)表達(dá)的程度顯著高于敲低細(xì)胞。L-選擇素mR

9、NA表達(dá)水平在對(duì)照組和敲低組細(xì)胞成軟骨、成骨分化過程中均升高，且對(duì)照組L-選擇素mRNA上調(diào)表達(dá)的程度高于敲低組。對(duì)照組細(xì)胞成軟骨、成骨分化后L-選擇素蛋白表達(dá)水平高于敲低組。
　　結(jié)論：
　　1、應(yīng)用人臍帶組織貼壁法可分離得到間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)觀察細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)特性以及細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)鑒定可明確為間充質(zhì)干細(xì)胞;
　　2、構(gòu)建的GPR126敲低慢病毒確實(shí)能降低GPR126的表達(dá)水平，得到2株GPR126敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)人臍