Wnt10b調(diào)節(jié)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨成脂分化的作用機制.pdf

1、目的:研究腺病毒介導(dǎo)的Wnt10b高表達(dá)或表達(dá)抑制對入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨成脂分化平衡的影響，探索Wnt10b通過經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)節(jié)人BMSCs成骨成脂分化的作用機制，為靶向Wnt10b基因治療骨質(zhì)疏松癥提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
　　方法:臨床篩選行全髖置換術(shù)患者(n=10)的骨髓液，應(yīng)用percoll梯度離心法分離出骨髓單核細(xì)胞，利用人BMSCs貼壁生長的特性純化人BMSCs，然后對其進行傳代培養(yǎng)，并應(yīng)用流式細(xì)

2、胞術(shù)鑒定人BMSCs;最后，選取2-4代的人BMSCs進行成骨和成脂誘導(dǎo)，并定期應(yīng)用堿性磷酸酶(ALP)染色、茜素紅（Alizarin Red S）染色和油紅(Oil Red-O)染色分別對人BMSCs向成骨和成脂分化的情況進行檢測。構(gòu)建腺病毒載體(Ad-Wnt10b，Ad-Wnt10b-shRNA，Ad-Null)并對其進行鑒定;將構(gòu)建成功的腺病毒載體瞬時轉(zhuǎn)染人BMSCs-包括四組:Wnt10b組(Ad-Wnt10b)、Wnt10b干

3、擾組（Ad-Wnt10b-shRNA）、空病毒組(Ad-Null)和空白對照組，然后應(yīng)用免疫熒光檢測各組細(xì)胞腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率，并將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞轉(zhuǎn)入含誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)（成骨誘導(dǎo)、成脂誘導(dǎo)或正常培養(yǎng)），定期應(yīng)用熒光定量PCR、ALP染色、免疫熒光和Westernblot對成骨分化的特異性功能基因(ALP)和調(diào)控成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(Runx2)及成脂分化的特異性功能基因(FABP4)和調(diào)控成脂分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(PPARγ2)

4、的mRNA及蛋白的表達(dá)量進行檢測，并觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（茜素紅染色、油紅染色），最后綜合分析Wnt10b基因高表達(dá)或表達(dá)缺失后對人BMSCs向成骨或成脂分化的影響。
　　結(jié)果:成功應(yīng)用percoll梯度離心分離出骨髓單核細(xì)胞，并根據(jù)貼壁生長的特性純化出人BMSCs，細(xì)胞鑒定成功并順利培養(yǎng)傳代，并在成骨或成脂誘導(dǎo)的條件下分別分化為成骨或成脂細(xì)胞。成功構(gòu)建腺病毒載體(Ad-Wnt10b，Ad-Wnt10b-shRNA，Ad-Null)

5、并轉(zhuǎn)染人BMSCs;轉(zhuǎn)染6h后，免疫熒光檢測各組腺病毒載體轉(zhuǎn)染成功。誘導(dǎo)3d后，熒光定量PCR檢測顯示:成骨誘導(dǎo)組的成骨分化特異性功能基因(ALP)和調(diào)控成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(Runx2)及成脂誘導(dǎo)組的成脂分化特異性功能基因（FABP4）和調(diào)控成脂分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(PPARγ2)的表達(dá)明顯高于正常培養(yǎng)組，且Wnt10b組相關(guān)成骨因子的表達(dá)高于其他對照組，相關(guān)成脂因子表達(dá)低于其他對照組，而Wnt10b干擾組的結(jié)果與Wnt10b組相反。

6、誘導(dǎo)7d后，成骨誘導(dǎo)組Wnt10b組的ALP染色呈強陽性，ALP定量高于對照組，而Wnt10b干擾組為弱陽性，ALP定量低于對照組;免疫熒光和Western Blot檢測顯示:成骨誘導(dǎo)Wnt10b組的成骨相關(guān)蛋白ALP和Runx2的表達(dá)高于對照組，Wnt10b干擾組則低于對照組，而成脂誘導(dǎo)Wnt10b組的成脂相關(guān)蛋白FABP4和PPARγ的表達(dá)低于對照組，Wnt10b干擾組則高于對照組。誘導(dǎo)14d后，成脂誘導(dǎo)Wnt10b干擾組Oil R