2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、研究目的:骨質(zhì)疏松是代謝性骨病一個(gè)典型的疾病,它的發(fā)病基礎(chǔ)是骨形成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡被打破。CKIP-1是一個(gè)近期廣受關(guān)注的蛋白,參與機(jī)體多項(xiàng)生理活動(dòng)過程,其中一個(gè)重要功能是骨形成的負(fù)調(diào)控作用,它通過增強(qiáng)泛素連接酶S mur f1中E3的活性來增強(qiáng)其作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞,并且是成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞,對(duì)它功能的調(diào)控能夠影響其成骨分化,從而影響機(jī)體的骨平衡代謝。本研究擬利用CKIP-1基因敲除小鼠模型,分別從大體

2、水平觀察CKIP-1影響小鼠整體骨質(zhì)狀況,細(xì)胞水平影響干細(xì)胞生物學(xué)特性及其成骨功能及分子水平初步探討成骨負(fù)調(diào)控作用的機(jī)制,以期從骨代謝成骨過程的負(fù)調(diào)控蛋白方面,進(jìn)一步揭示骨代謝的可能過程及機(jī)制,為骨質(zhì)疏松等骨代謝性疾病的研究及診療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
  研究方法:
  1.通過建立 CKIP-1基因敲除小鼠繁育體系,采用 PCR方法鑒定小鼠基因型,并測(cè)定小鼠從出生第二周至成年后的體重尾長(zhǎng)增長(zhǎng)變化,觀察分析小鼠大體水平發(fā)育情況。<

3、br>  2.利用Micro-CT、組織學(xué)染色等方法,測(cè)定WT(CKIP-1+/+)及KO(CKIP-1-/-)型小鼠股骨、椎骨及下頜骨骨質(zhì)影像學(xué)相關(guān)參數(shù)的差異,觀察其在組織學(xué)形態(tài)、結(jié)構(gòu)及CKIP-1蛋白定位及表達(dá)情況。
  3.分離培養(yǎng)WT(CKIP-1+/+)及KO(CKIP-1-/-)小鼠BMSCs,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)記分子表達(dá),多向分化實(shí)驗(yàn)測(cè)定成脂、成骨分化能力,證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞的來源及性質(zhì)。
  4.采用MTT

4、及平板克隆實(shí)驗(yàn),檢測(cè)WT及KO小鼠BMSCs增殖能力差異,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩者的細(xì)胞周期及凋亡情況,探討CKIP-1缺失是否對(duì)干細(xì)胞相關(guān)的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。
  5.對(duì)WT及KO小鼠BMSCs進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo),檢測(cè)其成骨及成脂能力差異;檢測(cè)兩組細(xì)胞堿性磷酸酶活性差異,并利用裸鼠顱骨缺損實(shí)驗(yàn)?zāi)P?,比較兩者BMSCs聯(lián)合纖維蛋白膠修復(fù)裸鼠骨缺損修復(fù)成骨能力,應(yīng)用 Micro-CT檢測(cè)新骨形成相對(duì)量,HE染色及Masso n三色染色比

5、較其新骨結(jié)構(gòu)差別。
  6.對(duì)WT及KO小鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)后,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法及Western Blot方法檢測(cè)成骨相關(guān)分子在mRNA及蛋白水平表達(dá)變化,以研究 CKIP-1影響干細(xì)胞成骨發(fā)育可能通過哪些分子產(chǎn)生作用。
  7.采用Western Blot方法檢測(cè)MAPK通路相關(guān)蛋白在WT及KO小鼠BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后表達(dá)的差異,探討CKIP-1調(diào)控成骨過程中產(chǎn)生變化的通路蛋白,及其磷酸化情況,揭示CKIP-1影

6、響成骨作用的可能機(jī)制。
  結(jié)果:
  1.采用鼠尾粗提法結(jié)合PCR擴(kuò)增進(jìn)行基因型鑒定,KO型小鼠不表達(dá)CKIP-1結(jié)構(gòu)中的3號(hào)外顯子,表達(dá)人工添加的neo抗性基因。選取同窩同性別的WT(CKIP+/+)及 KO(CKIP-/-)型小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),品相良好的雜合子進(jìn)行繁殖。并且,WT及KO小鼠自出生后至成年過程中,其體重和尾長(zhǎng)的增長(zhǎng)均符合線性規(guī)律,兩組并未體現(xiàn)出差異。
  2. Micro-CT結(jié)果顯示,在股骨及椎骨

7、中,KO小鼠的骨體積分?jǐn)?shù)及骨小梁數(shù)目均比WT小鼠增多,其特定骨表面面積及骨小梁間隙小于WT組;而在下頜骨中,其上述指標(biāo)未見顯著差異。WT及KO小鼠股骨、椎骨及下頜骨組織的HE染色顯示,兩者骨質(zhì)在大體結(jié)構(gòu)無明顯差異;免疫熒光染色顯示CKIP-1在椎骨、股骨及下頜骨表達(dá)較弱,在牙體組織尤其是牙本質(zhì)中也有表達(dá)。K O小鼠各樣本均無CK IP-1表達(dá)。
  3.利用WT及KO小鼠股骨密質(zhì)骨經(jīng)膠原酶消化,成功分離培養(yǎng)了間充質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞

8、術(shù)鑒定其大量表達(dá)間充質(zhì)來源細(xì)胞表面標(biāo)記CD90、CD105及sca-1,幾乎不表達(dá)造血系來源細(xì)胞的CD31和CD45,上述分子在WT組及KO組表達(dá)均無顯著差異。經(jīng)成骨成脂誘導(dǎo)后,發(fā)現(xiàn)KO小鼠BMSCs的成骨成脂能立均顯著強(qiáng)于WT組。
  4. MTT及平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,KO小鼠BMSCs增殖更快,其克隆形成能力更強(qiáng);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩者細(xì)胞周期顯示,KO組小鼠細(xì)胞的S期細(xì)胞數(shù)更多,增殖旺盛;而兩者在凋亡方面無顯著差別。
 

9、 5.經(jīng)成骨誘導(dǎo)后,KO組小鼠BMSCs顯示出更強(qiáng)的體外成骨能力,其茜素紅染色和ALP染色結(jié)果均顯著高于WT組;且KO組細(xì)胞堿性磷酸酶活性較WT組增強(qiáng);裸鼠顱骨缺損實(shí)驗(yàn)中,KO組細(xì)胞的體內(nèi)修復(fù)骨缺損能力強(qiáng)于WT組細(xì)胞,形成的類骨質(zhì)更多,且結(jié)構(gòu)更加成熟。
  6.在轉(zhuǎn)錄水平,成骨誘導(dǎo)后,CKIP-1表達(dá)下降,而轉(zhuǎn)錄因子Osterix及Runx2,成骨相關(guān)因子ALP、Col、BSP及OCN表達(dá)顯著增強(qiáng),KO組高于WT組。蛋白水平的檢測(cè)

10、結(jié)果與前述實(shí)驗(yàn)基本符合,成骨誘導(dǎo)后,KO組成骨相關(guān)因子表達(dá)高于WT組。
  7.對(duì)MAPK通路相關(guān)蛋白及其磷酸化水平檢測(cè)結(jié)果顯示,WT組小鼠表達(dá)CKIP-1蛋白,而KO組不表達(dá);經(jīng)成骨誘導(dǎo)后,KO組表達(dá)Smurf1低于WT組,而MEKK2表達(dá)顯著增強(qiáng),JNK、p-JNK、p-c-jun、p38及p-p38表達(dá)升高。此過程中未見ERK1/2、p-ERK1/2表達(dá)。
  結(jié)論:
  1.鼠尾粗提法結(jié)合PCR鑒定小鼠基因型較

11、為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)潔和高效。CKIP-1敲除不影響小鼠的出生及發(fā)育成熟,且小鼠的繁殖遵循孟德爾遺傳定律,此繁育體系可穩(wěn)定遺傳。
  2. KO型小鼠在大體骨質(zhì)方面,較WT小鼠骨質(zhì)增強(qiáng),并且在骨組織結(jié)構(gòu)方面顯示出更加優(yōu)化的結(jié)構(gòu);而在下頜骨中,這種變化并不明顯。CKIP-1在牙本質(zhì)中也有表達(dá),提示其可能與牙齒的形成及結(jié)構(gòu)相關(guān)。
  3. CKIP-1不影響干細(xì)胞表面標(biāo)記分子的表達(dá)及干細(xì)胞的凋亡;而可以抑制干細(xì)胞的克隆形成能力和增殖速率。

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