CKIP-1負(fù)調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化研究.pdf

1、研究目的：骨質(zhì)疏松是代謝性骨病一個(gè)典型的疾病，它的發(fā)病基礎(chǔ)是骨形成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡被打破。CKIP-1是一個(gè)近期廣受關(guān)注的蛋白，參與機(jī)體多項(xiàng)生理活動(dòng)過程，其中一個(gè)重要功能是骨形成的負(fù)調(diào)控作用，它通過增強(qiáng)泛素連接酶S mur f1中E3的活性來增強(qiáng)其作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞，并且是成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，對(duì)它功能的調(diào)控能夠影響其成骨分化，從而影響機(jī)體的骨平衡代謝。本研究擬利用CKIP-1基因敲除小鼠模型，分別從大體

2、水平觀察CKIP-1影響小鼠整體骨質(zhì)狀況，細(xì)胞水平影響干細(xì)胞生物學(xué)特性及其成骨功能及分子水平初步探討成骨負(fù)調(diào)控作用的機(jī)制，以期從骨代謝成骨過程的負(fù)調(diào)控蛋白方面，進(jìn)一步揭示骨代謝的可能過程及機(jī)制，為骨質(zhì)疏松等骨代謝性疾病的研究及診療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.通過建立 CKIP-1基因敲除小鼠繁育體系，采用 PCR方法鑒定小鼠基因型，并測(cè)定小鼠從出生第二周至成年后的體重尾長(zhǎng)增長(zhǎng)變化，觀察分析小鼠大體水平發(fā)育情況。<

3、br>　　2.利用Micro-CT、組織學(xué)染色等方法，測(cè)定WT（CKIP-1+/+）及KO（CKIP-1-/-）型小鼠股骨、椎骨及下頜骨骨質(zhì)影像學(xué)相關(guān)參數(shù)的差異，觀察其在組織學(xué)形態(tài)、結(jié)構(gòu)及CKIP-1蛋白定位及表達(dá)情況。
　　3.分離培養(yǎng)WT（CKIP-1+/+）及KO（CKIP-1-/-）小鼠BMSCs，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)記分子表達(dá)，多向分化實(shí)驗(yàn)測(cè)定成脂、成骨分化能力，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞的來源及性質(zhì)。
　　4.采用MTT

4、及平板克隆實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)WT及KO小鼠BMSCs增殖能力差異，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩者的細(xì)胞周期及凋亡情況，探討CKIP-1缺失是否對(duì)干細(xì)胞相關(guān)的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。
　　5.對(duì)WT及KO小鼠BMSCs進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)，檢測(cè)其成骨及成脂能力差異；檢測(cè)兩組細(xì)胞堿性磷酸酶活性差異，并利用裸鼠顱骨缺損實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，比較兩者BMSCs聯(lián)合纖維蛋白膠修復(fù)裸鼠骨缺損修復(fù)成骨能力，應(yīng)用 Micro-CT檢測(cè)新骨形成相對(duì)量，HE染色及Masso n三色染色比

5、較其新骨結(jié)構(gòu)差別。
　　6.對(duì)WT及KO小鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)后，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法及Western Blot方法檢測(cè)成骨相關(guān)分子在mRNA及蛋白水平表達(dá)變化，以研究 CKIP-1影響干細(xì)胞成骨發(fā)育可能通過哪些分子產(chǎn)生作用。
　　7.采用Western Blot方法檢測(cè)MAPK通路相關(guān)蛋白在WT及KO小鼠BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后表達(dá)的差異，探討CKIP-1調(diào)控成骨過程中產(chǎn)生變化的通路蛋白，及其磷酸化情況，揭示CKIP-1影

6、響成骨作用的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.采用鼠尾粗提法結(jié)合PCR擴(kuò)增進(jìn)行基因型鑒定，KO型小鼠不表達(dá)CKIP-1結(jié)構(gòu)中的3號(hào)外顯子，表達(dá)人工添加的neo抗性基因。選取同窩同性別的WT（CKIP+/+）及 KO（CKIP-/-）型小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，品相良好的雜合子進(jìn)行繁殖。并且，WT及KO小鼠自出生后至成年過程中，其體重和尾長(zhǎng)的增長(zhǎng)均符合線性規(guī)律，兩組并未體現(xiàn)出差異。
　　2. Micro-CT結(jié)果顯示，在股骨及椎骨

7、中，KO小鼠的骨體積分?jǐn)?shù)及骨小梁數(shù)目均比WT小鼠增多，其特定骨表面面積及骨小梁間隙小于WT組；而在下頜骨中，其上述指標(biāo)未見顯著差異。WT及KO小鼠股骨、椎骨及下頜骨組織的HE染色顯示，兩者骨質(zhì)在大體結(jié)構(gòu)無明顯差異；免疫熒光染色顯示CKIP-1在椎骨、股骨及下頜骨表達(dá)較弱，在牙體組織尤其是牙本質(zhì)中也有表達(dá)。K O小鼠各樣本均無CK IP-1表達(dá)。
　　3.利用WT及KO小鼠股骨密質(zhì)骨經(jīng)膠原酶消化，成功分離培養(yǎng)了間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞

8、術(shù)鑒定其大量表達(dá)間充質(zhì)來源細(xì)胞表面標(biāo)記CD90、CD105及sca-1，幾乎不表達(dá)造血系來源細(xì)胞的CD31和CD45，上述分子在WT組及KO組表達(dá)均無顯著差異。經(jīng)成骨成脂誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)KO小鼠BMSCs的成骨成脂能立均顯著強(qiáng)于WT組。
　　4. MTT及平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KO小鼠BMSCs增殖更快，其克隆形成能力更強(qiáng)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩者細(xì)胞周期顯示，KO組小鼠細(xì)胞的S期細(xì)胞數(shù)更多，增殖旺盛；而兩者在凋亡方面無顯著差別。
　

9、　5.經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，KO組小鼠BMSCs顯示出更強(qiáng)的體外成骨能力，其茜素紅染色和ALP染色結(jié)果均顯著高于WT組；且KO組細(xì)胞堿性磷酸酶活性較WT組增強(qiáng)；裸鼠顱骨缺損實(shí)驗(yàn)中，KO組細(xì)胞的體內(nèi)修復(fù)骨缺損能力強(qiáng)于WT組細(xì)胞，形成的類骨質(zhì)更多,且結(jié)構(gòu)更加成熟。
　　6.在轉(zhuǎn)錄水平，成骨誘導(dǎo)后，CKIP-1表達(dá)下降，而轉(zhuǎn)錄因子Osterix及Runx2，成骨相關(guān)因子ALP、Col、BSP及OCN表達(dá)顯著增強(qiáng)，KO組高于WT組。蛋白水平的檢測(cè)

10、結(jié)果與前述實(shí)驗(yàn)基本符合，成骨誘導(dǎo)后，KO組成骨相關(guān)因子表達(dá)高于WT組。
　　7.對(duì)MAPK通路相關(guān)蛋白及其磷酸化水平檢測(cè)結(jié)果顯示，WT組小鼠表達(dá)CKIP-1蛋白，而KO組不表達(dá)；經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，KO組表達(dá)Smurf1低于WT組，而MEKK2表達(dá)顯著增強(qiáng)，JNK、p-JNK、p-c-jun、p38及p-p38表達(dá)升高。此過程中未見ERK1/2、p-ERK1/2表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.鼠尾粗提法結(jié)合PCR鑒定小鼠基因型較

11、為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)潔和高效。CKIP-1敲除不影響小鼠的出生及發(fā)育成熟，且小鼠的繁殖遵循孟德爾遺傳定律，此繁育體系可穩(wěn)定遺傳。
　　2. KO型小鼠在大體骨質(zhì)方面，較WT小鼠骨質(zhì)增強(qiáng)，并且在骨組織結(jié)構(gòu)方面顯示出更加優(yōu)化的結(jié)構(gòu)；而在下頜骨中，這種變化并不明顯。CKIP-1在牙本質(zhì)中也有表達(dá)，提示其可能與牙齒的形成及結(jié)構(gòu)相關(guān)。
　　3. CKIP-1不影響干細(xì)胞表面標(biāo)記分子的表達(dá)及干細(xì)胞的凋亡；而可以抑制干細(xì)胞的克隆形成能力和增殖速率。