大腸桿菌LTB-Stx2B融合蛋白的表達(dá)及其誘導(dǎo)小鼠體液免疫的研究.pdf

1、犢牛大腸桿菌性腹瀉是牛場(chǎng)常發(fā)且危害嚴(yán)重的一種細(xì)菌性傳染病，主要表現(xiàn)為腸炎或敗血癥，是新生犢牛死亡的主要病因之一，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前尚無(wú)有效預(yù)防該病的商品化疫苗，因此，研制有效的針對(duì)該病的疫苗對(duì)預(yù)防該病的發(fā)生具有重要意義。
　　 引起犢牛腹瀉的大腸桿菌主要毒力因子有腸毒素（包括LT、ST）、志賀毒素和粘附素。LT和LTB具有很強(qiáng)的免疫原性并且具有免疫佐劑的功效，是近些年來(lái)疫苗研究的熱點(diǎn)。志賀毒素引起的犢牛腹瀉的死亡率

2、最高，它有兩個(gè)型，1型和2型，2型志賀毒素的毒性強(qiáng)于1型，是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的重要毒力因子，其B亞基無(wú)毒且具有免疫原性。ST單獨(dú)不具有免疫原性，而粘附素的抗原類(lèi)型又過(guò)多，因此，將大腸桿菌不耐熱腸毒素和志賀毒素作為疫苗抗原是研制犢牛大腸桿菌疫苗的主要策略。
　　 本研究旨在探索ltb和stx2b融合編碼基因的構(gòu)建，在原核系統(tǒng)中表達(dá)，以及表達(dá)蛋白誘導(dǎo)小鼠體液免疫的情況，為犢牛大腸桿菌疫苗的研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)和提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　

3、　 本研究將PCR擴(kuò)增出的ltb和stx2b基因用(一)段柔性linker序列連接后插入pMD18Tsimple載體中，經(jīng)序列分析鑒定后，再通過(guò)酶切，連接，轉(zhuǎn)化宿主菌Rossetta，分別構(gòu)建了Rossetta/pET-30a-LTB-Stx2B和Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B融合基因原核表達(dá)系統(tǒng)。經(jīng)表達(dá)條件優(yōu)化和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物分析，最終選擇表達(dá)系統(tǒng)Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B進(jìn)行后續(xù)研究。S

4、DS-PAGE分析和Western blot鑒定結(jié)果顯示，表達(dá)系統(tǒng)Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B所表達(dá)的重組蛋白量約占菌體蛋白的1/5。
　　 同時(shí)還構(gòu)建了表達(dá)stx2b基因的原核表達(dá)系統(tǒng)Rossetta/pCold I-Stx2B。SDS-PAGE分析和Western blot鑒定結(jié)果顯示，該重組蛋白同樣獲得了高效表達(dá)。
　　 隨機(jī)將昆明鼠分為5組（A、B、C、D、E組），每組正常鼠、妊娠鼠各5只

5、，E組為對(duì)照組。將重組蛋白LTB-Stx2B、重組蛋白Stx2B、重組大腸桿菌Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B滅活菌、重組大腸桿菌Rossetta/pCold I-LTB-Stx2B滅活菌超聲波裂解液與礦物油佐劑1∶1混合，經(jīng)腹腔免疫A～D組正常鼠及妊娠鼠，免疫2次，間隔2周，對(duì)正常鼠、母鼠及仔鼠采血檢測(cè)血清抗體。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，重組蛋白LTB-Stx2B能夠誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生抗LTB和抗Stx2B的特異性抗體

6、，二免疫后10d兩種抗體滴度均達(dá)到1∶10000以上，高于重組蛋白Stx2B免疫組及其他免疫組，并且產(chǎn)生的特異性抗體能夠傳遞給子代小鼠。
　　 二免后10d分別對(duì)各組小鼠腹腔注射5LD50的LT和5LD50的Stx2進(jìn)行體內(nèi)中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示,A～D組小鼠均獲得了不同程度的針對(duì)LT或Stx2的保護(hù)作用，其中，以重組蛋白LTB-Stx2B免疫組小鼠獲得的保護(hù)率最高（5/5健活）。
　　 用二免后各組高效價(jià)小鼠血清系列稀釋后