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1、本研究采用克隆測(cè)序技術(shù),首次測(cè)定了中國(guó)荷斯坦奶牛干擾素-τ(bIFN-τ)成熟蛋白基因的編碼區(qū)(CDS)全序列(GenBank登錄號(hào):DQ680846、DQ680847),并利用生物信息學(xué)方法對(duì)bIFN-τ的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測(cè),結(jié)果表明: bIFN-τ成熟蛋白基因的CDS全序列長(zhǎng)度為519bp,編碼172個(gè)氨基酸的bIFN-τ。對(duì)bIFN-τ成熟蛋白基因的CDS全序列和GenBank上已公布的相關(guān)序列進(jìn)行聚類分析,可將其聚為4
2、類,發(fā)現(xiàn)了新的一類bIFN-τ(τ4)和六種新亞型(τle、τ3f、τ3g、τ3h、τ4a、τ4b)。DQ680846屬于τ4類的一種亞型,標(biāo)記為τ4a;DQ680847屬于τ3類的一種亞型,標(biāo)記為τ3f。各bIFN-τ基因核苷酸序列間的同源性在92.7%~99.8%之間,推導(dǎo)氨基酸序列間的同源性在88.5%~99.4%之間;τ4a、τ3f與其他bIFN-τ基因核苷酸序列間的同源性分別在94.0%~97.1%、92.9%~99.6%之間
3、,推導(dǎo)氨基酸序列間的同源性分別在91.4%~96.0%、88.5%~99.4%之間。不同物種IFN-τ基因可聚為4類:普通牛與美洲野牛、水牛聚為一類;綿羊、山羊、麝香牛聚為另一類;大額牛、馬鹿、麝香鹿聚為第三類;長(zhǎng)頸鹿單獨(dú)為一類。各物種IFN-τ基因核苷酸序列間的同源性在84.6%~99.2%之間,推導(dǎo)氨基酸序列間的同源性在68.4%~97.7%之間;中國(guó)荷斯坦奶牛bIFN-τ基因τ4a和τ3f與其他物種IFN-τ基因核苷酸序列間的同源
4、性在87.7%~99.2%之間,推導(dǎo)氨基酸序列間的同源性在74.1%~97.7%之間。對(duì)blFN-τ的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)bIFN-τ氨基酸序列中有一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn),Asn78可被糖基化。blFN-τ中存在5個(gè)主要的疏水區(qū),分別位于氨基酸序列的53~68位、75~86位、96~104位、114~121位和139~156位。bIFN-τ氨基酸序列中有6個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn):Ser25、Serl37、Serl53、Ser
5、l55、Thr119和Tyr136。bIFN-τ的Gysl和Cys99、Cys29和Cysl39各自形成兩個(gè)二硫鍵,以維持其立體結(jié)構(gòu)。bIFN-τ的三維結(jié)構(gòu)是以5個(gè)α-螺旋為基礎(chǔ)構(gòu)成的,α-螺旋由111個(gè)氨基酸殘基形成,占64.53%;螺旋之間為無規(guī)卷曲,由61個(gè)氨基酸殘基形成,占35.47%。bIFN-τ氨基酸序列3~155位是包括IFN-α,β,ω,τ,δ等在內(nèi)的I型IFN家族的典型保守結(jié)構(gòu)功能域。由此可以推測(cè)出bIFN-τ具有I型
6、IFN所共有的抗病毒、抗細(xì)胞增生、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能。 本研究將bIFN-τ基因定向克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中,構(gòu)建了重組融合表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-blFN-τ,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),優(yōu)化表達(dá)條件,并初步純化重組融合蛋白,結(jié)果表明: blFN-τ基因在重組融合表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-bIFN-τ中的插入方向和讀碼框均正確;該基因已在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá),其表達(dá)
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