類鼻疽桿菌鞭毛蛋白FliC與腸出血性大腸桿菌蛋白EspA的融合表達(dá)及其免疫學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、類鼻疽(Melioidosis)疾病是由類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei)引起的一種熱帶亞熱帶地區(qū)人畜共患傳染病。由于類鼻疽病易感動(dòng)物的廣譜性、疾病的高致死性以及流行范圍不斷擴(kuò)大的趨勢(shì),該病已經(jīng)成為全球的公共衛(wèi)生問題。類鼻疽伯克霍爾德菌是一種革蘭氏陰性桿菌,有極高的感染性和對(duì)環(huán)境的極強(qiáng)的抵抗能力,已被美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心列為B類生物戰(zhàn)劑。此外臨床上類鼻疽桿菌感染的多重耐藥菌性,使得其感染的治療是異常

2、困難。因此發(fā)展新的預(yù)防和治療策略非常重要。
　　疫苗是預(yù)防和控制感染性疾病有效、經(jīng)濟(jì)的手段。就類鼻疽桿菌疫苗研究而言,已經(jīng)有很多研究就全菌滅活疫苗、成份疫苗、結(jié)合疫苗等方面進(jìn)行了嘗試,但目前還沒有一種應(yīng)用于臨床。重組亞單位疫苗是通過重組表達(dá)能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原分子(主要是蛋白抗原),從而達(dá)到預(yù)防和控制疾病的目的。亞單位疫苗因?yàn)槠涑煞萸宄?、質(zhì)量可控、成本較低,已經(jīng)成為新型疫苗發(fā)展的重要方向。
　　鞭毛蛋

3、白(flagellin,FliC)作為細(xì)菌表面主要抗原,其氨基酸序列高度保守,是引起免疫反應(yīng)的重要抗原成份之一,已廣泛用于該細(xì)菌感染的診斷,并可作為亞單位疫苗的候選抗原成份。本文分別采用pET22b、pET28a以及pGEX載體進(jìn)行FliC的表達(dá),結(jié)果均不理想。課題組前期在研究腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7的Ⅲ型分泌系統(tǒng)重要元件(EscheriochiacolisecretproteinA,EspA)的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)外

4、源蛋白表達(dá)的作用,并構(gòu)建了基于EspA的表達(dá)載體pEspA。本研究擬采用該表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)類鼻疽桿菌鞭毛蛋白FliC與EHECO157:H7EspA融合蛋白,并評(píng)價(jià)其免疫學(xué)性質(zhì),為發(fā)展針對(duì)類鼻疽桿菌和EHECO157:H7的二聯(lián)疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　方法
　　1bpsl3319基因的克隆和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　以類鼻疽桿菌BPC006基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增FliC編碼基因bpsl3319,通過DNA重組技術(shù)連接

5、到不同表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)、pET28a(+)、pGEX和pEspA,酶切后測(cè)序鑒定陽性重組子,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,獲得重組表達(dá)工程菌。
　　2重組蛋白EspA-FliC的表達(dá)和純化
　　重組工程菌pEspA-FliC經(jīng)IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后,超聲破菌,SDS-PAGE電泳分析重組蛋白EspA-FliC表達(dá)形式。EspA-FliC融合蛋白經(jīng)過包涵體洗滌、使用陰離子交換層析和凝膠過濾層析,純化后產(chǎn)物超濾離心濃縮,采用BC

6、A法測(cè)定蛋白濃度。
　　3融合蛋白EspA-FliC免疫學(xué)性質(zhì)研究
　　3.1融合蛋白的反應(yīng)性檢測(cè)Westernblot檢測(cè)融合蛋白與類鼻疽桿菌多抗和EspA單克隆抗體、EspA多抗免疫反應(yīng)性。
　　3.2融合蛋白的免疫原性檢測(cè)純化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,ELISA方法檢測(cè)血清特異性抗體的滴度;并通過Westernblot檢測(cè)免疫血清與類鼻疽桿菌全菌、融合蛋白及EspA的反應(yīng)性。
　　結(jié)果
　　1成

7、功克隆了類鼻疽桿菌FliC編碼基因bpsl3319,并構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-bpsl3319、pET28a-bpsl3319、pGEX-bpsl3319和pEspA-bpsl3319,FliC在前三種表達(dá)系統(tǒng)中未見明顯表達(dá),僅在pEspA系統(tǒng)獲得高效表達(dá)。
　　2重組工程菌pEspA-FliC/BL21經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后,融合蛋白EspA-FliC表達(dá)量約占菌體總蛋白的35％,純化后蛋白純度大于85%。
　　3Es

8、pA-FliC能分別與抗類鼻疽桿菌多克隆抗體、抗EspA的單抗或多抗血清發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng),表現(xiàn)出良好的免疫反應(yīng)性。
　　4EspA-FliC免疫Balb/c小鼠可刺激其產(chǎn)生高效價(jià)特異的IgG,而且此抗體能識(shí)別EspA-FliC、EspA以及天然類鼻疽桿菌的FliC,表現(xiàn)出良好的免疫原性。
　　結(jié)論
　　本研究采用DNA重組技術(shù)成功表達(dá)了具有良好免疫原性和免疫反應(yīng)性的類鼻疽桿菌鞭毛蛋白FliC與腸出血性大腸桿菌Es