大腸桿菌F18菌毛FedF蛋白及LTB-FedF融合蛋白的表達及免疫原性研究.pdf

1、本研究主要內(nèi)容： 1、產(chǎn)腸毒素性E.COliLT全基因的克隆與序列分析 根據(jù)GenBank中收錄的LT基因序列，設計并合成一對引物，以豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌臨床分離株ECOHl的DNA為模板，通過PCR技術(shù)擴增出約1.3kb的片段。將此PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMDTLT，測序結(jié)果表明所克隆的LT基因序列全長為1334bp，與GetlBank收錄的序列的核苷酸同源性在97.6％-98.8％之間。

2、 2、E Cili生株F18菌毛FedF基因的克隆表達及免疫原性研究 根據(jù)Z26520中fedF序列設計1對引物，從發(fā)病仔豬的腹瀉糞便分離獲得的大腸桿菌中擴增得到fedF基因，經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化，將其克隆到pMDl8-T中，所克隆fedF基因序列與GenBank中收錄的其他fedF基因序列的同源性在97.8％～99.2％。另設計1對引物，利用基因工程方法將所克隆的fedF的編碼序列亞克隆到表達載體。pBV220中，轉(zhuǎn)化大腸

3、桿菌BL21(DE3)LysS獲得表達重組菌。SDS-PAGE電泳及Western-blotting分析表明重組菌在誘導后可以表達特異性的FedF蛋白，該重組蛋白分子量約為30kDa。該重組蛋白的表達量占菌體總蛋白量的11.17％。將純化的重組FedF蛋白免疫小鼠，攻毒試驗表明免疫小鼠可完全抵抗致死性的E.c01i的感染。 3、大腸桿菌LTB-FedF融合蛋白的表達及免疫原性研究 經(jīng)PCR、酶切、連接和轉(zhuǎn)化將L.TB成熟

4、肽基因按預定的閱讀框架插入到表達質(zhì)粒pET28a(+)中，獲得重組質(zhì)粒pETLTB，用同樣的方法將fedF成熟肽基因片段插入到重組質(zhì)粒pPLTB中LTB基因的3’末端，獲得LTB-fedF融合基因的質(zhì)粒pETLTBFedF。SDS-PAGE與Western-blotting分析表明轉(zhuǎn)化該質(zhì)粒的重組大腸桿菌在IPTG誘導下可以高效表達融合蛋白LTB-FedF，該重組蛋白分子量約40kDa。該融合蛋白的表達量占菌體總蛋白量的23.17％。融