文昌魚幾個發(fā)育相關(guān)基因的研究及三崎柱頭蟲的形態(tài)學(xué)觀察.pdf

1、頭索動物文昌魚代表從無脊椎動物到脊椎動物進(jìn)化過程中一個重要的過渡階段。文昌魚軀體結(jié)構(gòu)較脊椎動物簡單，但其基本特征與脊椎動物的祖先極為相似，在胚胎發(fā)生及發(fā)育機(jī)制方面都與脊椎動物有很多相似之處，是研究脊椎動物形體模式發(fā)生機(jī)制進(jìn)化的最佳模型。另一方面，從比較基因組的角度看，文昌魚未曾經(jīng)歷脊椎動物中大范圍的基因倍增，因此它也是研究動物發(fā)育機(jī)制、脊椎動物起源和進(jìn)化的理想材料。目前對文昌魚的研究已深入到分子水平，文昌魚基因組測序也已經(jīng)接近完成，已經(jīng)

2、報道的文昌魚基因包括脊椎動物轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、信號分子、結(jié)構(gòu)基因和酶的同源基因等。隨著分子水平研究的深入，我們對文昌魚的發(fā)育機(jī)制與調(diào)控也有了進(jìn)一步的認(rèn)識。近些年的研究表明，對脊椎動物和與它親緣關(guān)系接近的類群之間進(jìn)行比較基因組分析、發(fā)育調(diào)控基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析以及比較發(fā)育生物學(xué)的研究，可以提供很多有關(guān)脊椎動物起源和進(jìn)化的線索，進(jìn)一步揭示進(jìn)化過程中基因和發(fā)育調(diào)控是如何改變的。但是，由于文昌魚取材困難，因而對其研究依然不夠充分，有待于繼續(xù)積累

3、數(shù)據(jù)，從而開展廣泛、系統(tǒng)、深入的研究。 柱頭蟲是在進(jìn)化上位于無脊椎動物和脊椎動物之間的另一類重要代表動物。作為對此類在進(jìn)化上有著重要地位的動物進(jìn)行深入研究的開始，本論文對柱頭蟲進(jìn)行了一系列形態(tài)學(xué)方面的研究，試圖為確定柱頭蟲的分類地位和闡明脊索動物的進(jìn)化提供資料，并為在柱頭蟲中開展分子生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。 本論文主要報道了與文昌魚背腹圖式形成及神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的幾個基因AmphiSox1/2/3-like，Thymosin-

4、β4，HMGB，RACK1及在文昌魚中新發(fā)現(xiàn)的Toll-like基因所進(jìn)行的研究工作。論文還描述了柱頭蟲形態(tài)學(xué)研究的結(jié)果。 首先介紹了文昌魚早期神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因AmphiSox1/2/3-like。AmphiSox1/2/3-like基因的演繹蛋白與佛羅里達(dá)文昌魚AmphiSox1/2/3的一致性最高，為64﹪，與海膽、海鞘、囊舌蟲、蠑螈、斑馬魚、雞、小鼠和人的Sox或是Sox1，Sox2和Sox3的一致性分別在36﹪-57﹪之

5、間。然而在其多肽鏈的C端，文昌魚缺乏一段50多個氨基酸的區(qū)域，而這一區(qū)域在脊椎動物的各個物種之間則是比較保守的。構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，Sox基因家族的進(jìn)化規(guī)律符合動物分類學(xué)中各物種的進(jìn)化地位。青島文昌魚和佛羅里達(dá)文昌魚AmphiSox1/2/3，以及海鞘Sox基因在進(jìn)化上非常接近，它們可能歧化于脊椎動物Sox基因出現(xiàn)多態(tài)性和基因倍增之前。 胚胎原位雜交的結(jié)果顯示，AmphiSox1/2/3-like基因的表達(dá)最早出現(xiàn)在原腸胚早、中期

6、背部上胚層細(xì)胞中，表達(dá)區(qū)域包括預(yù)定神經(jīng)外胚層。從早期神經(jīng)胚開始，表達(dá)區(qū)域便明顯地局限于背部神經(jīng)外胚層中，在整個神經(jīng)板中都有很強(qiáng)的表達(dá)。到了神經(jīng)板邊緣開始向背部翻卷時，表達(dá)區(qū)域隨之向兩側(cè)分離。在神經(jīng)管形成過程中，其表達(dá)區(qū)域主要位于神經(jīng)管和軀體中、后部形成中神經(jīng)管的兩側(cè)，表達(dá)的水平從前向后逐漸下調(diào)。到18h神經(jīng)胚期時，AmphiSox1/2/3-like在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)僅存在于軀體后部的神經(jīng)管中；同時，在背部消化道壁中也開始檢測到表達(dá)信號

7、。此后，該基因在神經(jīng)管中的表達(dá)便停止了，但是在消化道壁中仍然維持表達(dá)。在20h幼蟲的消化道壁中表達(dá)較強(qiáng)，隨后表達(dá)從后向前下調(diào)，逐漸集中于咽鰓區(qū)。至48h幼蟲時，已完全檢測不到AmphiSox1/2/3-like的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，文昌魚AmphiSox1/2/3-like基因的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)圖式與脊椎動物同源基因相似，它與文昌魚神經(jīng)組織的發(fā)育過程密切相關(guān)，可能在文昌魚神經(jīng)分化和消化道分化中起著重要的作用。 本論文首次在成體文昌

8、魚組織中研究了thymosin-β4，AmphiHMGB和AmphiRACK1三個基因的表達(dá)情況。我們此前的研究工作顯示，這三個基因在文昌魚的胚胎發(fā)育過程中，都與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生和消化道分化相關(guān)。然而對這些基因在成體文昌魚神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及其它組織器官中的功能還缺乏系統(tǒng)的分析。本部分工作采用組織學(xué)切片原位雜交和RT-PCR方法研究了上述三個基因在成體文昌魚中的表達(dá)圖式。原位雜交結(jié)果顯示，在神經(jīng)系統(tǒng)中，thymosin-β4基因在腦泡和神

9、經(jīng)索中的神經(jīng)元細(xì)胞核和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，在神經(jīng)索的背、腹神經(jīng)根中都有明顯的表達(dá)，在神經(jīng)索背側(cè)正上方的嵴中也有較強(qiáng)的表達(dá)。AmphiRACK1僅在文昌魚腦泡和神經(jīng)索中央管附近的神經(jīng)元細(xì)胞核中表達(dá)，而在其它神經(jīng)組織中則沒有檢測到它的表達(dá)信號。相反，AmphiHMGB在神經(jīng)索的外包膜中，在背、腹神經(jīng)根和神經(jīng)索背側(cè)正上方的嵴中有明顯的表達(dá)，而在神經(jīng)元細(xì)胞核中只有低水平的表達(dá)。 此外，這三個基因也以各自特異性的表達(dá)圖式在成體文昌魚的其它多種

10、器官組織中表達(dá)。在咽鰓區(qū)，thymosin-β4和AmphiRACK1在輪器中有明顯的表達(dá)，而在這一器官中未檢測到AmphiHMGB的表達(dá)。在鰓中，這三個基因在鰓片的纖毛柱狀上皮細(xì)胞、鰓片基部的鰓血管、隔膜腔、隔膜的骨軸中均有明顯表達(dá)，但它們在這些不同結(jié)構(gòu)中的表達(dá)部位和強(qiáng)度存在明顯的差別。在內(nèi)柱中，這三個基因在內(nèi)柱的腺細(xì)胞、中央和側(cè)面的纖毛細(xì)胞、內(nèi)柱下腔、腔細(xì)胞、內(nèi)柱骨板、內(nèi)柱下腹部動脈以及其中的血細(xì)胞中也分別有其不同的表達(dá)圖式。在消化

11、道中，AmphiRACK1在肝盲囊和腸的假復(fù)層柱狀上皮整個上皮細(xì)胞中都有明顯的表達(dá)；thymosin-β4只在細(xì)胞質(zhì)和絨毛中有較強(qiáng)的表達(dá)，而在細(xì)胞核中則表達(dá)較弱；AmphiHMGB在這里的表達(dá)圖式與thymosin-β4相似，只是在表達(dá)水平上整體較低。在成熟的雄性精巢和雌性卵巢中，三個基因也各有其特異性的表達(dá)圖式。 Thymosin-β4，AmphiHMGB和AmphiRACK1在成體文昌魚中的表達(dá)圖式與它們在脊椎動物中同源基因

12、的表達(dá)圖式相似。研究結(jié)果提示，在脊索動物的進(jìn)化過程中，thymosin-β4，HMGB和RACK1基因?qū)τ谏窠?jīng)系統(tǒng)和其它器官的功能具有保守的作用。 本論文首次分別在核酸和蛋白水平上，系統(tǒng)地研究了文昌魚中的Toll-like同源基因在胚胎發(fā)育和成體中的表達(dá)。根據(jù)佛羅里達(dá)文昌魚一段與其它物種的TLR基因存在相似性的未知序列設(shè)計引物，通過RT-PCR方法擴(kuò)增出一段934bp的序列。測序后經(jīng)比對，確定是TLR基因上的TIR區(qū)。以該序列為

13、模板，標(biāo)記探針。采用整體和組織學(xué)切片原位雜交、免疫組化、RT-PCR和WesternBlotting方法，在文昌魚中研究了該基因在胚胎發(fā)育過程和成體中的時空表達(dá)圖式。胚胎整體原位雜交的結(jié)果顯示，文昌魚Toll-like基因并沒有明顯的母源性表達(dá)。在原腸胚早期即將開始內(nèi)卷的中內(nèi)胚層細(xì)胞中首先檢測到了Toll-like基因微弱的表達(dá)信號。隨后，該基因表達(dá)迅速上調(diào)，在原腸胚中期整個分化中的中內(nèi)胚層中都有很強(qiáng)的表達(dá)。神經(jīng)胚早期，表達(dá)信號廣泛出現(xiàn)

14、在神經(jīng)板、預(yù)定脊索板、分化中的中胚層和原腸消化道中。隨著胚胎的發(fā)育和各組織器官原基的分化，表達(dá)區(qū)域逐步集中到形成中的神經(jīng)管、脊索和初生體節(jié)中。到神經(jīng)胚晚期，在神經(jīng)管和體節(jié)中的表達(dá)開始下調(diào)，僅在胚胎中后部的神經(jīng)管和尾芽處還能檢測到表達(dá)信號；但在肌節(jié)腔壁、臟壁中胚層和消化道上皮中仍有明顯的表達(dá)。幼蟲期時，在體腔壁和腸壁中有強(qiáng)烈的表達(dá)，在尾部尚未完全形成的體節(jié)、內(nèi)柱和背部血管中也可檢測到表達(dá)信號。在整個胚胎發(fā)育過程中，始終未在表皮組織中檢測到

15、Toll-like基因的表達(dá)。胚胎整體免疫組化方法得到的結(jié)果顯示，在胚胎發(fā)育過程中，文昌魚早期卵裂期胚胎中有母源性的Toll-like蛋白的存在，在此后各發(fā)育時期，該基因在蛋白水平的時空表達(dá)圖式與原位雜交所顯示的表達(dá)圖式是基本一致的。提取文昌魚胚胎發(fā)育各時期RNA和蛋白進(jìn)行RT-PCR和WesternBlotting分析所顯示的結(jié)果也分別與原位雜交和免疫組化的結(jié)果是一致的。 組織學(xué)切片原位雜交結(jié)果顯示，在成體文昌魚中，Toll-

16、like基因在神經(jīng)索及其背側(cè)的嵴中有顯著的表達(dá)。在體表皮膚中表達(dá)明顯，在肌肉中僅有微弱的表達(dá)，而在脊索中則完全沒有表達(dá)。在咽鰓區(qū)部位，在輪器上皮細(xì)胞、咽上皮細(xì)胞，鰓片及內(nèi)柱腺細(xì)胞中，Toll-like基因都有較為強(qiáng)烈的表達(dá)；在背部大動脈動脈腔中和體腔壁上附著的一些血淋巴細(xì)胞中也檢測到了該基因的表達(dá)。在消化系統(tǒng)的肝盲囊和腸的假復(fù)層柱狀上皮細(xì)胞中，Toll-like基因表達(dá)非常強(qiáng)烈。在雄性和雌性成熟的生殖腺中，Toll-like基因也有其特

17、異性的表達(dá)圖式。提取文昌魚成體各組織的RNA進(jìn)行RT-PCR分析顯示的結(jié)果與原位雜交結(jié)果基本一致，WesternBlotting的結(jié)果同樣表明，在成體文昌魚中有很強(qiáng)的TLR抗體免疫陽性信號。 文昌魚Toll-like基因在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)圖式說明，這一基因在早期胚胎發(fā)育的原腸作用、胚胎的前—后和背—腹的特化中都起著重要的作用。它與神經(jīng)管、脊索、體節(jié)、咽和腸等多種器官的發(fā)育密切相關(guān)，可能是個重要的母體效應(yīng)基因。Toll-lik

18、e受體在早期發(fā)育中的功能，在進(jìn)化上既有保守性又有多樣性。文昌魚Toll-like基因在成體各組織中的表達(dá)圖式也暗示文昌魚的免疫系統(tǒng)也與TLR有著密切的關(guān)系。 論文的第五部分介紹了對半索動物三崎柱頭蟲的形態(tài)學(xué)研究工作。實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)H·E·和三色染色切片的光鏡觀察，以及掃描電鏡和透射電鏡的觀察，對柱頭蟲的各部分體段進(jìn)行了組織學(xué)的系列研究，其中，對皮膚和生殖腺的研究最為深入細(xì)致。 本部分研究結(jié)果與頭索動物文昌魚進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)柱