青島文昌魚(yú)與斑馬魚(yú)BIRC5同源基因的研究.pdf

1、凋亡抑制蛋白家族(IAP/BIRC)是一個(gè)廣泛存在于從真菌到人的凋亡通路保守家族，不僅具有大多數(shù)基因家族進(jìn)化的特點(diǎn)——數(shù)目上的膨脹和結(jié)構(gòu)域組合模式的復(fù)雜多樣化；而且在許多病毒中也存在，是病毒提高其在宿主存活率的關(guān)鍵性基因，在病毒與其宿主共進(jìn)化的生存競(jìng)爭(zhēng)舞臺(tái)上扮演重要角色，在生物進(jìn)化中是一個(gè)相當(dāng)重要而活躍的基因家族。 目前對(duì)這個(gè)基因家族的進(jìn)化歷史還沒(méi)有系統(tǒng)研究過(guò)，我們通過(guò)系統(tǒng)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)判斷同源關(guān)系；基因定位與線(xiàn)

2、性相關(guān)性的比較基因組分析，以及內(nèi)外顯子模式的比較三個(gè)角度的綜合分析，對(duì)這個(gè)物種跨度大，結(jié)構(gòu)域模式復(fù)雜多樣，而且可能發(fā)生多次的病毒與宿主之間的基因交流事件的同源異形基因家族的進(jìn)化歷史進(jìn)行了合理追溯和分辨。 BIRC5是聯(lián)結(jié)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵分子，在適應(yīng)性免疫，神經(jīng)形成過(guò)程中起重要作用。其同源基因已經(jīng)在酵母，線(xiàn)蟲(chóng)，果蠅，爪蟾，小鼠與人中鑒定，這些研究表明BIRC5可能在線(xiàn)蟲(chóng)以后的進(jìn)化過(guò)程中獲得了抑制細(xì)胞凋亡的功能，從而形成

3、一個(gè)重要的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡通路的聯(lián)結(jié)點(diǎn)。我們對(duì)凋亡抑制蛋白家族的進(jìn)化分析表明BIRC5在脊椎動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了復(fù)制與丟失，而文昌魚(yú)和斑馬魚(yú)正是處于這兩個(gè)事件發(fā)生前的物種，因此我們選擇了對(duì)BIRC5進(jìn)行文昌魚(yú)與斑馬魚(yú)的跨物種比較研究。 我們釣取了青島文昌魚(yú)BIRC5(Bbt-BIRC5)的cDNA全長(zhǎng)和基因組序列，通過(guò)Southern blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Bbt-BIRC5在文昌魚(yú)只有一個(gè)拷貝。通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)Bbt-BIRC

4、5不存在多轉(zhuǎn)錄本。BIRC5從文昌魚(yú)開(kāi)始具有了保守的四外顯子模式以及與人survivinC端超螺旋最類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，顯示Bbt-BIRC5是類(lèi)似于脊椎動(dòng)物BIRC5的祖先基因。有趣的是，所有脊椎動(dòng)物BIRC5中都存在的CDC2/CylinE的磷酸化靶位點(diǎn)T34PE(D)在Bbt-BIRC5中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR，發(fā)現(xiàn)Bbt--BIRC5是一種胚胎性表達(dá)的基因，在成體中表達(dá)量很低。在文昌魚(yú)囊胚的形成和晚期的神經(jīng)胚發(fā)育中神經(jīng)管

5、，體節(jié)的分化和脊索的形成時(shí)期的表達(dá)量相對(duì)較高，可能在這些發(fā)育事件中具有重要作用。在文昌魚(yú)成體的的卵巢中表達(dá)量最高，在精巢，肝盲囊和消化道中的表達(dá)量也相對(duì)較高，分別是成體全魚(yú)的13，10．和5倍多，可能在精子，卵子形成過(guò)程和以及文昌魚(yú)肝盲囊，消化道器官的功能中起作用。金黃色葡萄球菌感染青島文昌魚(yú)，取不同感染時(shí)期的魚(yú)提取全魚(yú)總RNA并檢測(cè)Bbt-BIRC5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Bbt-BIRC5在感染18天到48天的魚(yú)中有輕微的上調(diào)，在57天和60天

6、的感染魚(yú)中則幾乎沒(méi)有表達(dá)。為了更加清晰的了解Bbt-BIRC5在組織水平的表達(dá)量差異，對(duì)感染與對(duì)照魚(yú)進(jìn)行成體切片原位雜交發(fā)現(xiàn)Bbt-BIRC5可能在感染魚(yú)的消化道表達(dá)量有上調(diào)BIRC5在斑馬魚(yú)中有兩個(gè)旁系同源基因Dra-BIRC5a／b，對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行克隆，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證了Dra-BIRC5a／b的存在。用殺鮭氣單胞菌感染斑馬魚(yú)14天后，利用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Dra-BIRC5a／b的組織表達(dá)譜。結(jié)果顯示Dra-BIRC5a／b組織

7、表達(dá)模式既有相似的地方，也存在著很明顯的差異：在正常魚(yú)中，Dra-BIRC5a和Dra-BIRC5b有著相似的表達(dá)模式，都在脾臟中表達(dá)量最高，不同是Dra-BIRC5b在卵巢中的表達(dá)量比Dra-BIRC5a要高許多。在感染后，這兩個(gè)基因也具有相似的變化模式：在脾臟的急劇上調(diào)和在肝臟的大幅下調(diào)，不同之處是Dra-BIRC5b在感染后的卵巢組織表達(dá)量有明顯的下調(diào)。Dra-BIRC5a和Dra-BIRC5b表達(dá)上調(diào)與免疫刺激的相關(guān)性提示它們?cè)?/p>

8、斑馬魚(yú)免疫中可能起作用。表達(dá)譜的相似與差異提示這兩個(gè)旁系同源基因在功能上可能即繼承了其祖先基因的特征，在一定程度上也存在著功能上的分化。 根據(jù)研究結(jié)果，我們認(rèn)為BIRC5是一個(gè)在生物進(jìn)化上相當(dāng)重要、活躍的基因，在脊椎動(dòng)物的進(jìn)化的過(guò)程中，經(jīng)歷了基因的分化與丟失，和基因結(jié)構(gòu)到基因功能等多方面的重大變化。對(duì)類(lèi)似祖先基因的Bbt-BIRC5和復(fù)制后的分化基因Dra-BIRC5a和Dra-BIRC5b的比較研究有助于理解BIRC5的功能進(jìn)