青島文昌魚與斑馬魚BIRC5同源基因的研究.pdf

1、凋亡抑制蛋白家族(IAP/BIRC)是一個廣泛存在于從真菌到人的凋亡通路保守家族，不僅具有大多數(shù)基因家族進化的特點——數(shù)目上的膨脹和結(jié)構(gòu)域組合模式的復雜多樣化；而且在許多病毒中也存在，是病毒提高其在宿主存活率的關(guān)鍵性基因，在病毒與其宿主共進化的生存競爭舞臺上扮演重要角色，在生物進化中是一個相當重要而活躍的基因家族。 目前對這個基因家族的進化歷史還沒有系統(tǒng)研究過，我們通過系統(tǒng)搜索數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)生樹判斷同源關(guān)系；基因定位與線

2、性相關(guān)性的比較基因組分析，以及內(nèi)外顯子模式的比較三個角度的綜合分析，對這個物種跨度大，結(jié)構(gòu)域模式復雜多樣，而且可能發(fā)生多次的病毒與宿主之間的基因交流事件的同源異形基因家族的進化歷史進行了合理追溯和分辨。 BIRC5是聯(lián)結(jié)細胞周期與細胞凋亡通路的關(guān)鍵分子，在適應性免疫，神經(jīng)形成過程中起重要作用。其同源基因已經(jīng)在酵母，線蟲，果蠅，爪蟾，小鼠與人中鑒定，這些研究表明BIRC5可能在線蟲以后的進化過程中獲得了抑制細胞凋亡的功能，從而形成

3、一個重要的細胞周期與細胞凋亡通路的聯(lián)結(jié)點。我們對凋亡抑制蛋白家族的進化分析表明BIRC5在脊椎動物進化過程中經(jīng)歷了復制與丟失，而文昌魚和斑馬魚正是處于這兩個事件發(fā)生前的物種，因此我們選擇了對BIRC5進行文昌魚與斑馬魚的跨物種比較研究。 我們釣取了青島文昌魚BIRC5(Bbt-BIRC5)的cDNA全長和基因組序列，通過Southern blot檢測發(fā)現(xiàn)Bbt-BIRC5在文昌魚只有一個拷貝。通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)Bbt-BIRC

4、5不存在多轉(zhuǎn)錄本。BIRC5從文昌魚開始具有了保守的四外顯子模式以及與人survivinC端超螺旋最類似的結(jié)構(gòu)，顯示Bbt-BIRC5是類似于脊椎動物BIRC5的祖先基因。有趣的是，所有脊椎動物BIRC5中都存在的CDC2/CylinE的磷酸化靶位點T34PE(D)在Bbt-BIRC5中沒有發(fā)現(xiàn)。 通過實時定量PCR，發(fā)現(xiàn)Bbt--BIRC5是一種胚胎性表達的基因，在成體中表達量很低。在文昌魚囊胚的形成和晚期的神經(jīng)胚發(fā)育中神經(jīng)管

5、，體節(jié)的分化和脊索的形成時期的表達量相對較高，可能在這些發(fā)育事件中具有重要作用。在文昌魚成體的的卵巢中表達量最高，在精巢，肝盲囊和消化道中的表達量也相對較高，分別是成體全魚的13，10．和5倍多，可能在精子，卵子形成過程和以及文昌魚肝盲囊，消化道器官的功能中起作用。金黃色葡萄球菌感染青島文昌魚，取不同感染時期的魚提取全魚總RNA并檢測Bbt-BIRC5的表達，發(fā)現(xiàn)Bbt-BIRC5在感染18天到48天的魚中有輕微的上調(diào)，在57天和60天

6、的感染魚中則幾乎沒有表達。為了更加清晰的了解Bbt-BIRC5在組織水平的表達量差異，對感染與對照魚進行成體切片原位雜交發(fā)現(xiàn)Bbt-BIRC5可能在感染魚的消化道表達量有上調(diào)BIRC5在斑馬魚中有兩個旁系同源基因Dra-BIRC5a／b，對這兩個基因進行克隆，通過測序驗證了Dra-BIRC5a／b的存在。用殺鮭氣單胞菌感染斑馬魚14天后，利用實時定量PCR方法檢測Dra-BIRC5a／b的組織表達譜。結(jié)果顯示Dra-BIRC5a／b組織

7、表達模式既有相似的地方，也存在著很明顯的差異：在正常魚中，Dra-BIRC5a和Dra-BIRC5b有著相似的表達模式，都在脾臟中表達量最高，不同是Dra-BIRC5b在卵巢中的表達量比Dra-BIRC5a要高許多。在感染后，這兩個基因也具有相似的變化模式：在脾臟的急劇上調(diào)和在肝臟的大幅下調(diào)，不同之處是Dra-BIRC5b在感染后的卵巢組織表達量有明顯的下調(diào)。Dra-BIRC5a和Dra-BIRC5b表達上調(diào)與免疫刺激的相關(guān)性提示它們在

8、斑馬魚免疫中可能起作用。表達譜的相似與差異提示這兩個旁系同源基因在功能上可能即繼承了其祖先基因的特征，在一定程度上也存在著功能上的分化。 根據(jù)研究結(jié)果，我們認為BIRC5是一個在生物進化上相當重要、活躍的基因，在脊椎動物的進化的過程中，經(jīng)歷了基因的分化與丟失，和基因結(jié)構(gòu)到基因功能等多方面的重大變化。對類似祖先基因的Bbt-BIRC5和復制后的分化基因Dra-BIRC5a和Dra-BIRC5b的比較研究有助于理解BIRC5的功能進