文昌魚肽聚糖識別蛋白基因的表達(dá)及功能.pdf

1、肽聚糖識別蛋白(PGRP)是重要的先天性免疫基因家族，它能夠有效地識別入侵病源細(xì)菌并啟動免疫反應(yīng)。PGRP已在軟體動物、昆蟲、棘皮動物以及包括人類在內(nèi)的脊椎動物中獲得鑒定。盡管這些PGRP在進化過程中，結(jié)構(gòu)上十分保守，但是無脊椎動物和脊椎動物的PGRP在免疫功能上具有明顯的差異。作為介于無脊椎動物和脊椎動物之間的過渡類型，關(guān)于文昌魚的PGRP我們?nèi)匀恢跎?。本論文從文昌魚(Branchiostoma japonicus)中克隆得到了一

2、個短型的PGRP基因，并對它的結(jié)構(gòu)、表達(dá)及功能進行了研究。
　　 我們在文昌魚中克隆了一個全長為895 bp的PGRP-S cDNA，該cDNA包含一個長度為753 bp的開放閱讀框，5’非翻譯區(qū)長18 bp，3’非翻譯區(qū)長124 bp，編碼一個250個氨基酸的蛋白，預(yù)測的分子量大約為26.5 kDa，利用SignalP3.0和TMHMM2.0分析得到其氨基端具有18個氨基酸的信號肽，并且序列中不存在穿膜螺旋結(jié)構(gòu)，因此推測PGR

3、P-S是一種分泌型的蛋白。與其他短型PGRP進行同源比對發(fā)現(xiàn)，文昌魚PGRP-S同樣具有羧基端保守的PGRP結(jié)構(gòu)域，并帶有T7噬菌體酰胺酶活性及Zn2+結(jié)合所必需的H116-Y151-H225-T231-C233活性位點。但在它的氨基端具有ChtBD1結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域在其他已知的PGRP中并沒有發(fā)現(xiàn)，表明文昌魚PGRP-S是短型PGRP家族中新成員。基因組DNA和cDNA的比較得出，文昌魚PGRP-S基因全長2640 bp，具有6個外

4、顯子和5個內(nèi)含子。文昌魚的前兩個外顯子在無脊椎動物及脊椎動物中都未找到高同源性的結(jié)構(gòu)，這與文昌魚PGRP-S是短型PGRP家族中新成員的結(jié)論相一致。文昌魚pgrp-s基因的表達(dá)具有組織特異性，其mRNA主要在肝盲囊、后腸和肌肉中表達(dá)。pgrp-s主要在肝盲囊和后腸中表達(dá)為消化系統(tǒng)是文昌魚免疫系統(tǒng)的中心提供了又一個的證據(jù)。為了深入了解文昌魚PGRP-S的功能以及ChtBD1結(jié)構(gòu)域與PGRP結(jié)構(gòu)域之間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，我們重組表達(dá)了文昌魚P

5、GRP-S的成熟蛋白(除去信號肽)rPGRP-S和截短的蛋白(除去ChtBD1結(jié)構(gòu)域)rP86/250用于功能分析。rPGRP-S和rP86/250能同Lys-type PGN、Dap-type PGN和幾丁質(zhì)結(jié)合。刪除ChtBD1結(jié)構(gòu)域并不影響對幾丁質(zhì)的結(jié)合。兩種蛋白也能和S.aureus，E.coli，和P.pastoris結(jié)合，這表明同昆蟲和哺乳動物的PGRP一樣，文昌魚PGRP-S是一種廣泛的模式識別受體，能夠識別細(xì)菌S.aur

6、eus和E.coli以及真菌P.pastoris。rPGRP-S和rP86/250能夠水解Lys-type PGN和Dap-type PGN，并且Lys-typePGN為最適底物。這些結(jié)果表明rPGRP-S和rP86/250具有酶活性，這種酶活性不依賴于ChtBD1結(jié)構(gòu)域。另外，rPGRP-S和rP86/250都具有抑菌活性，能夠殺死細(xì)菌S.aureus和E.coli以及真菌P.pastoris。刪除ChtBD1結(jié)構(gòu)域可使抑制真菌的能力

7、大大降低，這表明抑菌能力可能是所有脊索動物所具有的共同特征。
　　 PGRP結(jié)構(gòu)域可以被其間一些保守性相對較低的區(qū)域分隔成PGRP結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。PGRP結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在哺乳動物和昆蟲之間都是高度保守的。然而這些亞結(jié)構(gòu)域的功能仍然不是很清楚。為了進一步研究三個亞結(jié)構(gòu)域的功能，我們表達(dá)了rP120/250(除去PGRP結(jié)構(gòu)域Ⅲ)和rP174/250(除去PGRP結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ，僅保留結(jié)構(gòu)域Ⅰ)進行功能分析。rP120/250和r

8、P174/250仍然保持了對兩種PGNs和幾丁質(zhì)的高結(jié)合能力，并仍然能結(jié)合細(xì)菌S.aureus和E.coli以及真菌P.pastoris，但對S.aureus和P.pastoris結(jié)合能力都出現(xiàn)了降低。rP120/250和rP174/250均失去了對PGNs的酰胺酶活性，這表明完整的PGRP結(jié)構(gòu)域是酰胺酶活性所必須的結(jié)構(gòu)。刪除了PGRP結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅱ的重組蛋白rP120/250和rP174/250仍然對大腸桿菌就有較強的抑制作用，并呈現(xiàn)劑