青島文昌魚發(fā)育相關(guān)基因AmphiSom、Tropomyosin，eIF3k和文昌魚進(jìn)化學(xué)的研究.pdf

1、文昌魚(Amphioxus)屬頭索動(dòng)物(Cephalochordata)，代表著從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中一個(gè)重要的過渡階段。一方面，文昌魚形體結(jié)構(gòu)的基本特征與脊椎動(dòng)物的祖先極為相似，使之成為研究脊椎動(dòng)物形體模式發(fā)生機(jī)制進(jìn)化的最佳模型。另一方面從比較基因組的角度看，文昌魚與脊椎動(dòng)物的祖先歧化后獨(dú)立進(jìn)化長(zhǎng)達(dá)5.5億年，其自身種系的進(jìn)化史和特有的基因倍增、功能分化和基因丟失也不容忽視。近些年的研究表明，對(duì)脊椎動(dòng)物和與它親緣關(guān)系接近的類

2、群之間進(jìn)行比較基因組分析，發(fā)育調(diào)控基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析，以及比較發(fā)育生物學(xué)的研究，可以提供很多有關(guān)脊椎動(dòng)物起源和進(jìn)化的線索，進(jìn)一步揭示進(jìn)化過程中基因和發(fā)育調(diào)控是如何改變的。因此雖然文昌魚不是脊椎動(dòng)物的直接祖先，但是它是現(xiàn)存的與脊椎動(dòng)物直接祖先最接近的無脊椎動(dòng)物，是研究動(dòng)物進(jìn)化和動(dòng)物胚胎發(fā)育的典型材料。 本文首次報(bào)道了圍繞文昌魚發(fā)育相關(guān)基因AmphiSom、Tropomyosin和eIF3k的研究工作。 首先介紹文昌魚體

3、節(jié)分化相關(guān)基因AmphiSom。最初，AmphiSom是從文昌魚18h cDNA文庫(kù)中獲得的一個(gè)長(zhǎng)度為1200bp的序列，利用生物學(xué)軟件分析其可能有一個(gè)編碼154個(gè)氨基酸的開放閱讀框，分析cDNA序列發(fā)現(xiàn)在我們假定的起始密碼子之前有同框的終止密碼子，由此推測(cè)得到了一個(gè)完整的文昌魚AmphiSom的開放閱讀框。SouthernBlotting中，用多種內(nèi)切酶酶切后的基因組DNA與隨機(jī)引物標(biāo)記的AmphiSom DNA探針雜交，結(jié)果只有一條

4、帶存在，顯示在文昌魚中AmphiSom可能只有一個(gè)拷貝。原位雜交結(jié)果顯示AmphiSom的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分為兩個(gè)階段。首先在早于文昌魚受精后9h以前的發(fā)育階段沒有檢測(cè)到AmphiSom的轉(zhuǎn)錄本。從原腸胚晚期/神經(jīng)胚早期(受精后9h)開始，AmphiSom的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物位于前三個(gè)初生體節(jié)以及預(yù)定體節(jié)中胚層(PSM)；隨著早期胚胎的不斷發(fā)育，觀察到AmphiSom隨著體節(jié)的形成，在正在形成中的體節(jié)和初生體節(jié)中保持較強(qiáng)的表達(dá)，同時(shí)，在已經(jīng) 形成的體節(jié)

5、中，表達(dá)迅速下調(diào)；整個(gè)神經(jīng)胚期，AmphiSom在新生體節(jié)和正在形成的體節(jié)中的雜交信號(hào)可以很明顯的觀察到；之后隨著發(fā)育的進(jìn)行，肌節(jié)中的AmphiSom轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物開始由前向后沿著前后軸逐漸減少，即仍然在發(fā)育中的肌節(jié)中保留，但雜交信號(hào)逐漸減弱，在已形成的體節(jié)中逐漸消失，在尾芽中有著強(qiáng)表達(dá)；在幼蟲時(shí)期，沿前后軸的最后端尾芽處仍能觀察到AmphiSom的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；在受精后72h的幼蟲中未檢測(cè)到AmphiSom的雜交信號(hào)。我在成體的切片原位雜交中，

6、發(fā)現(xiàn)AmphiSom在卵巢、肝盲囊、腸壁和微血管中有表達(dá)。 通過文獻(xiàn)可以得知，Wnt信號(hào)與體節(jié)的分化相關(guān)，而LiCl處理胚胎又會(huì)影響wnt信號(hào)通路，因此我利用AmphiMRF2作為參照，進(jìn)一步研究了AmphiSom在LiCl處理胚胎中的表達(dá)圖式。對(duì)文昌魚AmphiMRF2和AmphiSom發(fā)育表達(dá)模式的比較研究表明，這兩個(gè)基因在神經(jīng)胚期的表達(dá)區(qū)域均擴(kuò)大，表達(dá)強(qiáng)度都有所加強(qiáng)，不僅在中胚層在內(nèi)胚層也有所表達(dá)。因此我認(rèn)為AmphiSom

7、可能和Wnt信號(hào)通路有一定的關(guān)系，為了進(jìn)一步研究AmphiSom的功能，我構(gòu)建了AmphiSom的體內(nèi)表達(dá)載體。 其次，因試圖對(duì)文昌魚的脊索、肌肉以及體節(jié)的發(fā)育有一個(gè)系統(tǒng)的研究，我又合成引物得到了文昌魚的Tropomyosin基因。利用RT-PCR的方法得到它的全長(zhǎng)，該基因編碼一段284個(gè)氨基酸殘基的多肽，和其他物種的Tropomyosin有很高的同源性。將文昌魚丁Tropomyosin和在其他物種中的同源物進(jìn)行比對(duì)建樹，發(fā)

8、現(xiàn)和傳統(tǒng)的分類學(xué)觀點(diǎn)一致。通過原位雜交我了解到，Tropomyosin在文昌魚早期發(fā)育的表達(dá)最早從原腸胚晚期神經(jīng)胚早期開始，在原腸胚期定位于分化中的中內(nèi)胚層。到神經(jīng)胚期，Tropomyosin，的表達(dá)出現(xiàn)在發(fā)育中的體節(jié)和脊索中。隨著發(fā)育的進(jìn)行，Tropomyosin的表達(dá)穩(wěn)定的集中在體節(jié)、脊索處。到72小時(shí)幼蟲階段，Tropomyosin的表達(dá)仍然在肌節(jié)內(nèi)。成體的切片原位雜交結(jié)果顯示，在文昌魚成體中，Tropomyosin肌節(jié)中的表達(dá)大

9、幅度下調(diào)，只有很微弱表達(dá)，而在神經(jīng)管細(xì)胞和脊索處仍然可以檢測(cè)到表達(dá)的明顯存在，在外胚層和表皮內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)雜交信號(hào)。研究結(jié)果表明，Tropomyosin的 表達(dá)不僅與文昌魚多種早期發(fā)育事件相關(guān)，參與文昌魚胚胎軀體模式的構(gòu)建，而且在成體的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。 通過cDNA文庫(kù)的大規(guī)模的測(cè)序，我得到一段EST，經(jīng)過Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)和其他物種elF3k基因有著很高的同源性。該cDNA有930bp個(gè)堿基組成。與人，小鼠，挪威鼠，狗，牛

10、，斑馬魚，爪蟾，果蠅同源基因的同源性都在67％以上。并且該編碼蛋白含有elF3k蛋白特殊的結(jié)構(gòu)域，我們命名該基因?yàn)槲牟~elF3k基因。我用總共11個(gè)不同物種的elF3k同源物比對(duì)進(jìn)行建樹，分析該基因的系統(tǒng)進(jìn)化。并且通過原位雜交研究其在文昌魚中的表達(dá)模式。原位雜交結(jié)果顯示，文昌魚中elF3k最初從卵裂期開始表達(dá)，集中在受精卵和四細(xì)胞期的細(xì)胞質(zhì)中。到了囊胚期，elF3k的表達(dá)下調(diào)，逐漸消失，一直持續(xù)到原腸胚期，整個(gè)胚胎中都檢測(cè)不到elF3

11、k的轉(zhuǎn)錄本，到了12小時(shí)神經(jīng)胚期，文昌魚elF3k的表達(dá)逐漸出現(xiàn)在神經(jīng)外胚層和背部中胚層中，神經(jīng)板區(qū)域有著明顯的表達(dá)。隨著發(fā)育的進(jìn)行，到了神經(jīng)胚晚期，elF3k的表達(dá)主要集中在消化道和肌節(jié)，并且隨著發(fā)育的進(jìn)行，文昌魚elF3k穩(wěn)定的表達(dá)在神經(jīng)管、體節(jié)和消化管壁中，一直到幼蟲階段我發(fā)現(xiàn)elF3k在鰓區(qū)有著特異性的表達(dá)。在文昌魚成體中，elF3k的表達(dá)并不象胚胎中在肌肉中有著明顯的表達(dá)，elF3k在肌肉中的表達(dá)下調(diào)，表達(dá)區(qū)域主要集中在神經(jīng)管

12、、肝盲囊、腸和體腔壁，尤其在神經(jīng)索中有著強(qiáng)烈的表達(dá)。說明文昌魚elF3k足基因也許和文昌魚的神經(jīng)形成以及神經(jīng)功能的行使相關(guān)，對(duì)于進(jìn)一步的研究神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)化有著比較重要的意義。 鐵在所有的細(xì)胞的代謝中起著重要的作用，例如細(xì)胞氧的運(yùn)輸、電子傳遞、DNA的復(fù)制、光合作用和細(xì)胞的增殖等代謝過程都與鐵的功能密切相關(guān)。同時(shí)鐵是一些蛋白質(zhì)的必需成分(例如在酶，輔因子中)。對(duì)于生物體而言，在細(xì)胞內(nèi)鐵的代謝和其穩(wěn)態(tài)的維持是必須的，由轉(zhuǎn)鐵蛋白

13、進(jìn)行鐵的吸收和通過鐵蛋白ferritin進(jìn)行的鐵的匯集共同形成了鐵的穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的控制一般是通過后翻譯調(diào)控來控制的。但是 由于鐵的不可溶性，若在胞質(zhì)內(nèi)自由存在對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性，所以體內(nèi)需要存在儲(chǔ)存鐵的蛋白質(zhì)。鐵蛋白ferritin (apo ferritin-fecomplex)是在很多生物有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)鐵貯存和礦化蛋白。我研究和報(bào)道了文昌魚鐵蛋白ferritin一個(gè)亞基的同源基因的全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)文昌魚鐵蛋白ferri