文昌魚calreticulin基因的鑒定、表達(dá)和功能研究.pdf

1、鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的主要Ca2+結(jié)合蛋白，分子大小46 kDa，由三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)功能域所組成，包括球狀的N-功能域，延伸的P-功能域和酸性的C-功能域。N-末端功能域有信號(hào)肽序列，指引蛋白到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有兩個(gè)半胱氨酸殘基，參與二硫鍵的形成，不同物種間N-末端的功能域均非常保守。相比之下，C-功能域是最不保守的，但是，該區(qū)域含有一個(gè)十分保守內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)。位于N-

2、功能域和C-功能域之間的是脯氨酸豐富的P-功能域。
　　迄今為止，CRT已經(jīng)在高等植物、無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物得到廣泛鑒定，但是至今為止關(guān)于頭索動(dòng)物文昌魚，這一個(gè)研究進(jìn)化的重要的物種，報(bào)道卻很少。本文我們首次克隆并鑒定得到青島文昌魚（Branchiostoma japonicum）的CRT的cDNA序列，命名為Bjcrt。Bjcrt全長(zhǎng)為2848 bp，包含一個(gè)1275 bp的開放閱讀框（ORF）,5'-端非翻譯區(qū)（5'-UTR）8

3、7 bp,和3'-端非翻譯區(qū)（3'-UTR）1486 bp的。預(yù)測(cè)文昌魚CRT由424個(gè)氨基酸組成，分子大小為約49.5 kDa，有一個(gè)16個(gè)氨基酸殘基疏水性信號(hào)肽序列，包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域(N-, P-, C-結(jié)構(gòu)域)和一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)，有CRT的典型特征，包括位于N-功能域的CRT家族典型特征序列KHEQKIDCGGGYI和 IMFGPDICG，P-功能域的兩個(gè)三倍重復(fù)序列 A(PXXIXDPDAXKPEDWDE)和B(GXWXPPXI

4、XNPXYX)，以及C-功能域末端的保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列（KDEL）。
　　基因結(jié)構(gòu)分析顯示文昌魚和脊椎動(dòng)物CRT外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)一樣，都含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，而且每個(gè)編碼外顯子的長(zhǎng)度與脊椎動(dòng)物CRT基因如此的相似。表明CRT在脊索動(dòng)物的演化過程中高度保守，為我們提供了一個(gè)有關(guān)CRT基因轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控在頭索動(dòng)物文昌魚和脊椎動(dòng)物中是相似的的線索。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明青島文昌魚CRT基因位于脊椎動(dòng)物CRT序列底部，表明文昌魚CRT基

5、因是脊椎動(dòng)物CRT進(jìn)化的原型。
　　CRT在文昌魚多個(gè)組織中（肝盲囊、鰓、肌肉、脊索、后腸、精巢和卵巢）特異性表達(dá)，其中在脊索中表達(dá)量最高。CRT是一個(gè)多功能蛋白，它的這種廣泛的組織分布可能與在不同組織中發(fā)揮作用有關(guān)，這需要進(jìn)一步展開研究。
　　我們構(gòu)建文昌魚CRT大腸桿菌體外表達(dá)系統(tǒng)，得到純化的文昌魚CRT重組蛋白BjCRT，首次驗(yàn)證了純化的重組蛋白BjCRT能夠結(jié)合革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌，除此之

6、外，運(yùn)用密度梯度離心的方法提起新鮮的鱸魚巨噬細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀技術(shù)分析得出文昌魚重組蛋白 BjCRT能夠促進(jìn)鱸魚巨噬細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的吞噬作用。文昌魚 CRT表現(xiàn)出顯著的調(diào)理素的功能，能夠促進(jìn)宿主的吞噬細(xì)胞殺死入侵的細(xì)菌。
　　綜上所述，本論文研究了文昌魚 CRT基因的克隆、鑒定和表達(dá)方式。證明了文昌魚 CRT與革蘭氏陽性菌-金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌-大腸桿菌特異性結(jié)合，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌和大腸