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1、1.兔BMSCs細(xì)胞成骨方向誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定
目的: 探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中基因表達(dá)模式。方法: 抽取兔股骨遠(yuǎn)端骨髓,全骨髓貼壁法培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用條件培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo),用RT-PCR的方法檢測(cè)ALP、OPN、collagen-Ⅰ、bFGF和OC基因的表達(dá),并對(duì)BMSCs表面抗原CD44及ALP活性進(jìn)行鑒定。結(jié)果: 誘導(dǎo)培養(yǎng)后,OPN、、ALP、collagen-Ⅰ、OC、bFGF基因分別于第1
2、、2代細(xì)胞正常表達(dá),BMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)第一代檢測(cè)抗原CD44陽(yáng)性率達(dá)44.4%,ALP含量增高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論: 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)中自原代到第2代逐漸向成骨細(xì)胞分化,成骨細(xì)胞特異性基因順序表達(dá),已具備成骨細(xì)胞特征,此為進(jìn)一步探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化基因表達(dá)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
2.bFGF-慢病毒真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
目的: 構(gòu)建攜帶人bFGF基因的慢病毒載體,構(gòu)建攜帶GFP基因
3、的慢病毒載體作為對(duì)照,分別轉(zhuǎn)染成骨方向誘導(dǎo)的BMSCs,鑒定bFGF和GFP基因的表達(dá)。方法: 設(shè)計(jì)人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盤組織RNA,用RT-PCR的方法擴(kuò)增出bFGF基因,連接至pLenti6/V5-D-TOPO? 表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ雙酶切和DNA測(cè)序證實(shí)質(zhì)粒正確構(gòu)建。在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine 2000的介導(dǎo)下,bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表達(dá)質(zhì)粒同包裝質(zhì)粒pLP
4、1、pLP2、 包膜質(zhì)粒pLP/VSVG 共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞株,收集bFGF-慢病毒上清轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后第2代的兔BMSCs。設(shè)計(jì)GFP基因引物,以GFP-PMSLV-Plazmid為模板,PCR的方法擴(kuò)增出GFP基因,連接至pLenti6/V5-D-TOPO? 表達(dá)質(zhì)粒,GFP-慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染BMSCs過(guò)程同bFGF-慢病毒。RT-PCR方法檢測(cè)bFGF mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果: 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,對(duì)照組BMSCs可見(jiàn)綠色熒光蛋白
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