激肽釋放酶結(jié)合蛋白抑制高糖誘導的人視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞增殖作用的研究.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，是世界性的重要致盲性眼病，它的非增殖期表現(xiàn)包括微血管瘤、視網(wǎng)膜內(nèi)出血、視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常，增殖期表現(xiàn)為新生血管形成、玻璃體積血或視網(wǎng)膜前出血。眼內(nèi)新生血管生成是增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(Proliferative diabeticretinopathy，PDR)惡化和視力喪失的主要原因。新生血管導致的出血、滲出和增生牽引導致眼內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能破壞，終

2、至視力喪失。所以，尋找有效的方法來防止和治療DR迫在眉睫。內(nèi)源性血管生成抑制因子激肽釋放酶結(jié)合蛋白(Kallistatin，Kallikrein-Binding Protein，KBP)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中的一員，有多種生物功能，包括調(diào)節(jié)血壓、抗炎、血管松弛和刺激內(nèi)膜增生等。研究發(fā)現(xiàn)KBP是一種血管生成抑制劑，能夠抑制腫瘤組織的新生血管反應(yīng)，也可抑制大鼠后肢缺血模型的自發(fā)性血管生成，但是KBP對于人眼部視網(wǎng)膜新生血管的作用研究不多

3、。本研究在人眼部組織標本實驗及離體細胞培養(yǎng)實驗中探討了KBP與糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管形成的關(guān)系。
　　第一部分 KBP在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體中表達水平的研究
　　目的：
　　探討KBP是否參與糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管的形成。
　　方法：
　　臨床因特發(fā)性黃斑裂孔、特發(fā)性黃斑前膜和PDR需行玻璃體切割手術(shù)的患者，糖尿病患者根據(jù)1999年WHO診斷標準確診為2型糖尿病。分為2組:無糖尿病病史的特發(fā)

4、性黃斑裂孔、特發(fā)性黃斑前膜患者作為對照組;因PDR手術(shù)的患者，為PDR組。25G玻璃體切割手術(shù)標準三通道切口完成后，將1ml注射器接玻切頭的抽吸通道側(cè)，玻切頭進入前部玻璃體腔，未開灌注前，高速切割并抽吸玻璃體保存。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測玻璃體中KBP的表達。
　　結(jié)果：
　　ELISA檢測結(jié)果顯示對照組玻璃體KBP含量為38.48±1.97μg/ml，PDR組玻璃體 KBP含量為18.35±2.74μg/m

5、l，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=16.59，P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　糖尿病視網(wǎng)膜病變PDR期患者玻璃體中KBP表達下降，可能與PDR的形成相關(guān)，KBP可能對糖尿病視網(wǎng)膜新生血管的形成有抑制作用。
　　第二部分 KBP抑制高糖誘導的人視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞增殖作用的研究
　　目的：
　　觀察KBP對高糖誘導的人視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞增殖是否有抑制作用。
　　方法：
　　1.將人視網(wǎng)膜毛

6、細血管內(nèi)皮細胞(Human retinal endothelial cells，HRECs)分成兩組，分別加入5mM和30mM濃度糖溶液干預(yù)24h后提取細胞RNA，檢測不同糖濃度對KBP及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的影響。
　　2.將細胞分成4組:加5mM濃度葡萄糖，加30mM濃度葡萄糖，加30mM濃度葡萄糖及100nM KBP或1000nM KBP。將細胞加入96孔板中，每孔約1000細胞，待細胞貼壁，饑餓處理24h，加入

7、不同濃度葡萄糖及KBP干預(yù)24h，再加入CCK-810μl，37℃培養(yǎng)箱放置2-4h，酶聯(lián)儀檢測每孔內(nèi)450nm波長的吸光度（OD值），記錄分析。收集細胞，進行western blot檢測VEGF的蛋白表達。
　　3.將細胞分成3組:加5mM濃度葡萄糖，加30mM濃度葡萄糖，加30rmM濃度葡萄糖及1000nM KBP。細胞遷移用24孔板，Transwell小室裝置，細胞饑餓過夜加入膜上層，下層加入不同濃度葡萄糖和KBP，24h后

8、，記錄膜下層的細胞數(shù)。
　　4.將細胞分成3組:加5mM濃度葡萄糖，加30mM濃度葡萄糖，加30mM濃度葡萄糖及1000nM KBP。將HRECs以及不同濃度的葡萄糖及KBP加入到含Matrigel基質(zhì)膠的96孔板內(nèi)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)8h后拍照，管腔數(shù)目統(tǒng)計分析。
　　5.將細胞分成兩組:一組導入干擾KBP基因表達的siRNA，一組導入空載siRNA。在5mM葡萄糖環(huán)境下進行CCK-8實驗、細胞遷移實驗、管腔形成實驗。分別記錄結(jié)果

9、統(tǒng)計。
　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR結(jié)果顯示，與5mM糖濃度相比，30mM糖濃度刺激HRECs中KBP及VEGF的表達（P＜0.05）。
　　2.與5mM糖濃度相比，30mM糖濃度促進細胞的增殖遷移及管腔形成，加入了100nM KBP或1000nM KBP后，這些作用被抑制(P＜0.05)。
　　3.VEGF的蛋白表達在30mM葡萄糖+1000nmol/L KBP組低于30mM葡萄糖組。
　　4.在5m

10、M糖濃度環(huán)境下，用KBP siRNA干擾KBP基因表達可以提高細胞增殖遷移管腔形成的能力（P＜0.05）。
　　5.在5mM糖濃度環(huán)境下，用KBP siRNA干擾細胞KBP基因，VEGF蛋白表達增加。
　　結(jié)論：
　　1.高糖促進HRECs KBP及VEGF基因表達。
　　2.100nM KBP或1000nMKBP抑制高糖刺激誘導的HRECs增殖。
　　3.1000nMKBP抑制高糖刺激誘導的HRECs中V