MicroRNA-23b調(diào)節(jié)膿毒癥血管內(nèi)皮細胞炎癥因子的表達及在膿毒癥患者外周血白細胞的表達.pdf

1、本文分兩個部分進行探討：
　　第一部分 microRNA-23b調(diào)節(jié)膿毒癥臍靜脈血管內(nèi)皮細胞炎癥因子的表達
　　通過細菌脂多糖(LPS)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)，然后轉(zhuǎn)染mir-23b的模仿劑或者抑制劑進入細胞，并觀察轉(zhuǎn)染對mir-23b表達的上調(diào)和抑制作用，對膿毒癥血管內(nèi)皮細胞表達的炎癥調(diào)節(jié)因子的影響。進而探討mir-23b作為膿毒癥的靶點以及生物標志物的可能性。
　　方法:
　　mir-23b抑制

2、劑和模擬劑分別被轉(zhuǎn)染到人血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)從而分別抑制和上調(diào)mir-23b表達。抑制劑和模擬劑的陰性對照(NC)同樣進行轉(zhuǎn)染以便對照。觀察LPS刺激后4h和8h后各組細胞NF-κB、TNF-α、IL-6、E選擇素、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達和mRNA的表達，以及miR-23b表達的熒光圖片，進行分析和比較。組間行x2檢驗或t檢驗，SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為有顯著差異。
　　結(jié)果:

3、　　1、轉(zhuǎn)染mir-23b抑制劑抑制了人臍靜脈的內(nèi)皮細胞中的mir-23b的表達;轉(zhuǎn)染模擬劑則可促進mir-23b的表達
　　使用熒光顯微鏡可見人臍靜脈的內(nèi)皮細胞中，mir-23b發(fā)出綠色熒光。而定量PCR的結(jié)果則表明，mir-23b抑制劑的轉(zhuǎn)染組與空白對照組及NC組相比較，其mir-23b的表達可見顯著的降低，表明mir-23b抑制劑的轉(zhuǎn)染抑制mir-23b的表達有效。與此相反，mir-23b模擬劑的轉(zhuǎn)染組與空白組和NC組的模擬

4、劑組相比，則發(fā)現(xiàn)mir-23b的表達增高，表明mir-23b模擬劑的轉(zhuǎn)染可促進mir-23b表達。
　　2、LPS下調(diào)入臍靜脈的內(nèi)皮細胞中mir-23b的表達
　　LPS刺激的人臍靜脈的內(nèi)皮細胞模擬膿毒癥中血管內(nèi)皮細胞。結(jié)果顯示，相比沒有用LPS刺激細胞表達的miR-23b，轉(zhuǎn)染顯著模擬劑對照和拮抗劑對照的細胞LPS刺激4h或8h后的miR-23b表達明顯下降(P＜0.01)。結(jié)果表明，在LPS刺激導(dǎo)致人臍靜脈的內(nèi)皮細胞的m

5、ir-23b表達減少，在膿毒癥中血管內(nèi)皮細胞活化伴有mir-23b表達的抑制。相反，在模擬劑轉(zhuǎn)染組與沒有LPS刺激的細胞相比較，LPS刺激后4h、8h檢測發(fā)現(xiàn)，mir-23b表達輕微下降，但仍處于高水平。在抑制劑的轉(zhuǎn)染組中，LPS刺激后內(nèi)皮細胞所表達的mir-23b則仍然很低。
　　3、LPS促進炎性細胞因子表達的影響
　　LPS刺激人臍靜脈內(nèi)皮細后4h、8h檢測發(fā)現(xiàn)，炎性因子NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，

6、VCAM-1和E-選擇素E均顯著增加(P＜0.05)，表明LPS刺激的人臍靜脈的內(nèi)皮細胞表達炎性細胞因子，進而導(dǎo)致膿毒癥中的炎癥反應(yīng)。
　　4、mir-23b模擬劑抑制LPS刺激后炎癥因子的表達
　　LPS刺激人臍靜脈的內(nèi)皮細胞4h、8h在轉(zhuǎn)染模擬NC組的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1， VCAM-1和E-選擇素mRNA表達明顯增加(P＜0.05)，與轉(zhuǎn)染模擬劑組有明顯差異(P＜0.05)。Western b

7、lot分析結(jié)果表明，LPS刺激后4h檢測發(fā)現(xiàn)，模擬劑轉(zhuǎn)染組的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1和E-選擇素的蛋白水平，明顯低于模擬劑NC組4h(P＜0.05)。LPS刺激后8h檢測發(fā)現(xiàn)，VCAM-1的蛋白水平在模擬劑的轉(zhuǎn)染組顯著的低于模仿劑NC的轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)。
　　5、mir-23b抑制劑的轉(zhuǎn)染對LPS刺激以后細胞的炎癥因子的表達產(chǎn)生影響
　　抑制劑NC轉(zhuǎn)染組LPS刺激4h、8h后檢測發(fā)現(xiàn)，其NF-κB

8、，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和選擇素E的表達，比其刺激以前的水平有顯著的增加(P＜0.05)。這些炎性因子的表達水平在抑制劑轉(zhuǎn)染組LPS刺激后與刺激前比較，也明顯升高(P＜0.05)。此外，抑制劑轉(zhuǎn)染組與抑制劑NC轉(zhuǎn)染組比較，LPS刺激后4h、8h后炎性因子水平顯著升高。Western blot分析表明，與抑制劑NC轉(zhuǎn)染組比較，LPS刺激后4h、8h抑制劑轉(zhuǎn)染組細胞的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，E選擇素和V

9、CAM-1蛋白表達水平顯著增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　LPS刺激后內(nèi)皮細胞的miR-23b表達下降，而轉(zhuǎn)染miR-23b模擬劑后，LPS刺激內(nèi)皮細胞后NF-κB，IL-6，ICAM-1，VCAM-1，選擇素E的表達下降，而轉(zhuǎn)染miR-23b抑制劑后，LPS刺激內(nèi)皮細胞后NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1、選擇素E的表達上調(diào)。以往研究表明，這些炎性因子均是膿毒癥炎癥網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(inflamm

10、atorynetwork)的重要組成因子，在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。因而我們認為，miR-23b可以通過抑制血管內(nèi)皮細胞炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-6、E選擇素、ICAM-1、VCAM-1的釋放，進而對膿毒癥進行調(diào)節(jié)。
　　第二部分 microRNA-23b在膿毒癥患者外周血的表達
　　收集樣本外周血取自20例膿毒癥患者、10例SIRS患者及10例正常對照組人群，記錄相關(guān)的臨床資料，并采用mirVana

11、 PARIS Kit方法進行樣本外周血的血清中RNA抽提，然后使用AllinOne的miRNA qRT-PCR法對miRNA-23b在血清中的相對定量進行檢測，同時測定血中WBC計數(shù)、血清TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的變化，并結(jié)合患者的臨床資料測定SOFA評分，比較膿毒癥、SIRS及正常對照組血清中miRNA-23b表達的差異，分析血清miRNA-23b的表達與膿毒癥患者SOFA評分、WBC計數(shù)、血清TNF-α

12、、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的關(guān)系，并分析膿毒癥死亡組與存活組之間的差異，從而判定其與臨床指標及預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果
　　1、miR-23b的檢測靈敏度以及線性范圍
　　miR-23b和U6檢測的最低檢出界限為6.97 pg/μL RNA，在6.97～6.97×104pμL的RNA范圍內(nèi)miR-23b和U6測定的Ct值與RNA濃度之間存在良好的線性相關(guān)關(guān)系(r＞0.999)。
　　2、外周血中

13、miR-23b的溫度穩(wěn)定性
　　在4℃保存外周血循環(huán)血，1、3及5d后，其總定量RNA從51.32 ng/μL下降至18.3 ng/μL，由此可見總RNA的降解隨保存時間的延長同步增多。而外周循環(huán)血的白細胞中miR-23b和U6的表達水平則沒有明顯變化。
　　3、膿毒癥患者病情分析
　　20例膿毒癥患者中病情分布為:心內(nèi)膜炎患者2例，膽道感染患者2例，腹膜炎患者4例，肺部感染患者12例。28 d病死率為20％(4/20

14、); SOFA評分2～11分，平均（5.8±2.52）分。
　　4、外周血中miR-23b、WBC、血清中TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α的比值變化
　　與對照組相比較，膿毒癥組對象的miR-23b表達顯著降低(P＜0.01)，同時其血液中的WBC、IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值均顯著升高(P＜0.01);而膿毒癥組與SIRS組之間比較，各項指標均沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

15、
　　5、預(yù)后不同，膿毒癥病患組內(nèi)miR-23b、血清中IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值之間的差異
　　膿毒癥患者組中死亡患者與存活患者相比較，miR-23b表達量明顯降低(P=0.003，P＜0.01)，而血清中IL-10的水平則明顯升高(P=0.037，P＜0.01)。兩組患者的組間白細胞數(shù)(P=0.584)，血清中TNF-α水平(P=0.324)以及IL-10和TNF-α的比值(P=0.263

16、)均沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　6、膿毒癥患者的miR-23b水平與其自身的WBC、血清中TNF-α、IL-10的水平以及SOFA評分之間的關(guān)系
　　膿毒癥患者外周血miR-23b表達所需的循環(huán)數(shù)與其自身的SOFA評分、血清中的TNF-α和IL-10呈顯著相關(guān)（其r值分別為0.473、0.485和0.470，P＜0.05）;其與WBC計數(shù)（r值分別為0.301）以及IL-10和TNF-α的比值均無明顯相關(guān)(r

17、值為0.039，P＞0.05)。
　　7、IL-10、TNF-α在膿毒癥組病患的表達水平及兩者的比值和SOFA評分之間的關(guān)系
　　膿毒癥患者的SOFA評分與血清中的IL-10(r值為0.369)、TNF-α(r值為0.410)和IL-10與TNF-α的比值(r值分別為0.124)均無明顯的相關(guān)性(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　miRNA-23b的表達水平在膿毒癥組患者較正常對照組明顯下降，但與SIRS組患者相