膿毒癥大鼠肺血管內(nèi)皮細胞的變化及谷氨酰胺對其保護作用的研究.pdf

1、研究目的： 本研究通過建立膿毒癥大鼠模型，測定各組大鼠肺組織含水量、肺血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)凋亡的變化、肺VEC細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和E—選擇素蛋白表達的變化，以及肺組織ICAM-1和E—選擇素mRNA表達的變化，觀察肺VEC病理形態(tài)學(xué)的變化；探討谷氨酰胺對膿毒癥大鼠肺VEC的保護作用及其可能的機

2、制。 材料與方法： 1、實驗分組 SD大鼠56只，隨機分成3組：對照組(18只)、膿毒癥組(18只)和治療組(18只)。用靜脈注射給藥方法，膿毒癥組注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)4mg/kg；治療組注射LPS4mg/kg+谷氨酰胺0.3g/kg；對照組注射生理鹽水。各組動物按照觀察時間點平均分為造模后6h、12h和24h各3個亞組。 2、模型制作 用0.1％的戊巴比妥

3、鈉4ml/kg作腹腔內(nèi)注射麻醉后，將大鼠于仰臥位固定。于右側(cè)大腿作縱切口找到股靜脈。用靜脈注射給藥方法，注射LPS4mg/kg，制備膿毒癥動物模型。 3、檢測指標和方法 在造模后6h、12h和24h時點處死相應(yīng)實驗組的大鼠，快速分離左肺組織，測定其肺組織含水量。快速分離右肺下葉經(jīng)4％多聚甲醛固定12～16h，制成石蠟切片，H．E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察標本形態(tài)學(xué)變化；進行免疫組織化學(xué)染色檢測肺VEC ICAM-1和E—選擇

4、素蛋白的表達；進行Hoechest33258染色法觀察肺VEC的凋亡。分離右肺中葉，應(yīng)用RT—PCR方法檢測ICAM-1和E—選擇素mRNA的表達。分離右肺上葉，組織切塊(約1mm×1mm×2mm)投入2.5％戊二醛固定液固定后，電鏡觀察。 4、統(tǒng)計學(xué)處理 本研究的數(shù)據(jù)采取SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗資料均以均數(shù)±標準差(-x±S)表示；多組間比較用方差分析；對于不同處理組的兩兩比較，主要利用了LSD—t法

5、檢驗。以p<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、肺組織含水量 在6h和12h時點各組肺組織含水量無顯著差異(p>0.05)；在24h時點各組肺組織含水量，膿毒癥組>治療組>對照組，各組肺組織含水量有顯著差異(p<0.01)。 2、肺VEC凋亡的變化 在6h、12h和24h時點上，膿毒癥組大鼠肺VEC凋亡多于治療組(p<0.05)和對照組(p<0.01)；治療組大鼠VEC凋亡多于對照組(p<

6、0.01)。膿毒癥組和治療組隨著建模時間的延長，VEC凋亡逐漸增加；各時點之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。 3、肺VEC ICAM-1蛋白表達的變化 在6h、12h和24h時點上，膿毒癥組大鼠肺VEC ICAM-1蛋白的表達高于治療組(p<0.01)和對照組(p<0.01)；治療組大鼠肺VEC ICAM-1蛋白的表達高于對照組(p<0.05)。膿毒癥組和治療組隨著建模時間的延長，ICAM-1蛋白的表達逐漸增高

7、，24h達到高峰；各時點之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。 4、肺VEC E—選擇素蛋白表達的變化 在6h和12h時點上，膿毒癥組大鼠肺VEC E—選擇素蛋白的表達高于治療組(p<0.01)和對照組(p<0.01)；治療組大鼠肺VEC E—選擇素蛋白的表達高于對照組(p<0.05)。在24h時點各組之間E一選擇素蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。膿毒癥組和治療組E—選擇素蛋白的表達6h達到高峰，12h

8、回落，24h基本與對照組在同一水平；各時點之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。 5、肺組織ICAM-1 mRNA表達的變化 在6h、12h和24h時點上，膿毒癥組大鼠肺組織ICAM-1 mRNA的表達高于治療組(p<0.01)和對照組(p<0.01)，治療組大鼠肺組織ICAM-1 mRNA的表達高于對照組(p<0.05)。膿毒癥組和治療組隨著建模時間的延長，ICAM-1 mRNA的表達逐漸增高，24h達到高峰；各

9、時點之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。 6、肺組織E—選擇素mRNA表達的變化 在6h和12h時點上，膿毒癥組大鼠肺組織E—選擇素mRNA的表達明顯高于治療組(p<0.01)和對照組(p<0.01)，治療組大鼠肺組織E—選擇素mRNA的表達明顯高于對照組(p<0.05)。在24h時點各組之間E—選擇素mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。膿毒癥組和治療組E—選擇素mRNA的表達6h達到高峰，12h回落

10、，24h基本與對照組在同一水平；6h、12h和24h各時點之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。 7、肺組織光鏡下的變化 對照組肺部組織結(jié)構(gòu)正常。膿毒癥組肺泡壁增厚及中性粒細胞浸潤，毛細血管擴張，肺間質(zhì)水腫，肺泡腔及小血管內(nèi)紅細胞聚集。隨著建模時間的延長，可見肺泡間隔增寬斷裂，肺泡腔內(nèi)可見大量的紅細胞及中性粒細胞浸潤。治療組與膿毒癥組相比，肺水腫及細胞浸潤現(xiàn)象有明顯的改善。 8、肺組織電子顯微鏡下的變化

11、 對照組肺部組織結(jié)構(gòu)正常，肺VEC形態(tài)正常。膿毒癥組肺VEC內(nèi)出現(xiàn)空泡、細胞器腫脹、細胞器溶解等壞死表現(xiàn)，以及核染色質(zhì)邊集、核碎裂、核膜破裂等凋亡表現(xiàn)；同時可見肺微血管基底膜增厚，細胞間隙水腫，肺泡壁增厚及毛細血管擴張，肺間質(zhì)水腫，紅細胞及中性粒細胞浸潤等表現(xiàn)。隨著建模時間的延長，上述表現(xiàn)逐漸加重，肺泡間隔增寬斷裂，肺泡腔內(nèi)大量的紅細胞及中性粒細胞浸潤。治療組與膿毒癥組相比，肺VEC壞死和凋亡比例相對較少，肺水腫及細胞浸潤現(xiàn)象相對較