家蠶細胞色素P450的基因表達調(diào)控研究.pdf

1、家蠶細胞色素P450基因的表達調(diào)控研究中文摘要細胞色素P450是參與外源和內(nèi)源化合物合成、分解的一種重要代謝酶系。包括參與殺蟲劑和植物次生物質(zhì)的代謝以及蛻皮激素、保幼激素、性信息素的合成，與昆蟲的生長、發(fā)育和防御密切相關(guān)。為了研究家蠶細胞色素P4503家族基因與蛻皮激素的代謝關(guān)系和細胞色素P4504家族基因與蕓香苷的代謝關(guān)系，本研究用RealtimePCR和雙熒光檢測系統(tǒng)對CYP3家族和CYP4家族基因功能和調(diào)控機制進行研究，結(jié)果如下：

2、采用雙跟蹤標定定量PCR(dualspikeinqPCR)方法，檢測在蛻皮激素誘導下家蠶中腸和脂肪體內(nèi)CYP3基因家族的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明：與對照相比，在蛻皮激素誘導下家蠶幼蟲脂肪體中CYP302CYP306和CYP339的轉(zhuǎn)錄水平分別上升了191.47.4和421倍，在中腸中變化不顯著；其余基因轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯或檢測不到轉(zhuǎn)錄活性。說明CYP339基因最有可能參與家蠶蛻皮激素的代謝，這為進一步研究P450基因與內(nèi)源物質(zhì)的關(guān)系提供理論基

3、礎(chǔ)。選兩個代表基因CYP339和CYP306研究與蛻皮激素代謝相關(guān)的基因表達調(diào)控機制，對其啟動子區(qū)域的功能進行了分析；構(gòu)建了含熒光素酶報告基因和啟動子不同長度缺失片段(2000bp1600bp1200bp800bp400bp左右)的重組質(zhì)粒，和內(nèi)參載體pRLTK共轉(zhuǎn)染BmN細胞，通過蛻皮激素誘導，瞬時表達后用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測啟動子活性。功能分析結(jié)果表明：CYP306基因5個缺失片段中只有pGL33061pGL33062具有

4、啟動子活性，CYP339基因的5個啟動子片段均具轉(zhuǎn)錄活性，其中都是長1600bp的片段轉(zhuǎn)錄活性最高。說明這兩個基因的5調(diào)控區(qū)在1200bp片段與1600bp片段之間可能存在轉(zhuǎn)錄增強因子的結(jié)合位點，而在其上游可能存在轉(zhuǎn)錄抑制因子的結(jié)合位點。210221032104μgμL三個濃度的蛻皮激素溶液誘導細胞后，2個基因的10個缺失片段活性較未誘導細胞變化不一，其中經(jīng)2103μgμL的蛻皮激素誘導后增幅最明顯，最高增幅可達10倍左右，表明受蛻皮激

5、素誘導家蠶后CYP306CYP339基因的上調(diào)表達與其基因IIITheresearchofexpressionalregulationofcytochromeP450insilkwmBombyxmiAbstractCytochromeP450isanimptantmetabolicenzymeswhichisinvolvedinthesynthesisdecompositionofexogenousendogenouscompounds

6、.CytochromeP450hasavarietyoffunctionsintheinsectslifesuchasparticipationinthemetabolismofpesticidesplantsecondarythesynthesisofecdysonejuvenilehmonesexpheromones.AtthesametimecytochromeP450hasacloselyrelationshipwiththeg

7、rowthdevelopmentdefenseofinsect.WestudiedthefunctionsregulationmechanismoftheCYP3CYP4familygenesinsilkwmindertoresearchtherelationshipcytochromeP450metabolismofsubstancesinvivo.Theresultsarelistedasfollows:Wemeasuredthet

8、ranionlevelofCYP3familybydualspikeinqPCRingutfatbodyafterinducedBombyxmiwithecdysone(2103gL).TheresultsshowthatthetranionlevelofCYP302CYP306CYP339wereincreasedrespectivelyby191.4times7.4times421timesinfatbodythelevelofth

9、eremaininggenetranioninducedbytheecdysonedidnotchangesignificantlyundetectablethetranionalactivity.ThatCYP339genemaybeinvolvedinthemetabolismofsilkwmecdysone.Thiswklayedatheroyfoundationffurtherstudytherelationshipbetwee

10、nP450genesthemetabolismofendogenoussubstances.Wechosedtwogenes(CYP306CYP339)studiedthemechanismsunderlyingregulationofthesegeneswhichrelatedtothemetabolismofecdysone.IndertostudythemechanismsunderlyingregulationofCYP306C

11、YP339functionalanalysisofthepromoterofCYP306CYP339fromBombyxmiwasperfmedinthisstudy.Luciferaserepterplasscontainingseriallydpromoterfragments(2000bp1600bp1200bp800bp400bp)ofthetwogenesweretransientlytransfectedintoBmNcel