間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌機(jī)制修復(fù)大鼠急性肺損傷的基礎(chǔ)研究.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合(acuterespiratory distress syndrome，ARDS)是臨床常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)危重疾病，發(fā)展快，病死率高，社會(huì)危害重。ALI和ARDS常由創(chuàng)傷、感染、膿毒癥、休克、體外循環(huán)和廣泛的燒傷等因素引起。ALI患者如果不及時(shí)治療常發(fā)展為ARDS。目前間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)用于肺部疾病的基礎(chǔ)研究和治療多有報(bào)

2、道，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者從不同角度探討MSC用于ALI和ARDS治療的作用機(jī)制。盡管有關(guān)干細(xì)胞用于ALI治療的基礎(chǔ)研究報(bào)道較多，但機(jī)制仍未完全闡明。
　　肺泡上皮細(xì)胞在肺泡液清除過(guò)程發(fā)揮重要作用，肺泡上皮細(xì)胞清除肺泡內(nèi)電解質(zhì)和水分子的作用被定義為(Alveolar fluid clearance，AFC)，MSC分泌的生長(zhǎng)因子可能具有促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)離子和水分子功能，從而保持肺泡的干燥。AFC對(duì)于判斷病人的預(yù)后有重要的參考價(jià)值，A

3、LI過(guò)程合并AFC的受損，AFC與患者的死亡率密切相關(guān)。
　　所以本課題基于MSCs緩解炎癥反應(yīng)，降低急性肺損傷，但MSCs修復(fù)受損的AFC報(bào)道較少，機(jī)制不明。AT-Ⅱ細(xì)胞受損后AFC能力降低，AFC對(duì)判斷患者的預(yù)后有重要參考價(jià)值，所以探明MSCs旁分泌機(jī)制修復(fù)肺上皮細(xì)胞的AFC能力具有重要的意義。
　　方法:
　　1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定:麻醉并處死SD大鼠，分離大鼠股骨及脛骨骨髓腔內(nèi)細(xì)胞至培養(yǎng)皿，細(xì)胞貼

4、壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-MSC，BM-MSC).24小時(shí)后更換培養(yǎng)基，此后每三天剛換一次培養(yǎng)基，放置細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)(5％C02，37℃)。細(xì)胞生長(zhǎng)至80％酶消化法傳代，3-6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)技術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記物，使用成脂及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)BM-MSCs，鑒定MSC多項(xiàng)分化潛能。單克隆實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞自我復(fù)制能力，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)BM-MSC表面標(biāo)記物。
　　2.肺二型上皮細(xì)胞

5、的分離培養(yǎng)及鑒定:麻醉并處死SD大鼠，消毒、抗凝后放置超凈臺(tái)。打開(kāi)胸腔，沖洗肺循環(huán)至肺組織發(fā)白。剪出肺組織使用PBS液沖洗肺遠(yuǎn)端氣道。利用胰蛋白酶消化、差速離心、細(xì)胞貼壁的方法分離大鼠AT-Ⅱ細(xì)胞。DMEM/F12培養(yǎng)細(xì)胞，利用免疫熒光技術(shù)，肺泡表面活性物質(zhì)(surfactant protein A，SP-A)鑒定大鼠AT-Ⅱ細(xì)胞。
　　3.共培養(yǎng)模型的建立:本實(shí)驗(yàn)探索MSCs旁分泌機(jī)制修復(fù)受損后的AT-Ⅱ細(xì)胞，建立共培養(yǎng)體系。<

6、br>　　4.AT-Ⅱ細(xì)胞細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):利用CCK-8試劑檢測(cè)AT-Ⅱ在炎癥刺激后增殖情況以及共培養(yǎng)后MSCs對(duì)AT-Ⅱ細(xì)胞的影響作用。首先AT-Ⅱ(1×104)于上室培養(yǎng)，建立炎癥環(huán)境，構(gòu)建炎癥環(huán)境的三個(gè)主要促炎癥因子TNF-α、IL6和IL1-β，因子濃度分別為1.7ng/ml，87.6ng/ml和4.4ng/ml用以損傷AT-Ⅱ;正常培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)AT-Ⅱ細(xì)胞作為陰性對(duì)照；MSCs與炎癥刺激后的AT-Ⅱ共培養(yǎng)。連續(xù)觀察

7、72h測(cè)定細(xì)胞增殖，應(yīng)用酶標(biāo)儀(450nm)測(cè)定光密度。
　　5.KGF分泌以及KGF-SiRNA干擾效率分析:MSC促進(jìn)炎癥刺激后AT-Ⅱ的增殖活性。我們建立了如下四種共培養(yǎng)體系，各組的實(shí)驗(yàn)條件如下:①M(fèi)SCs，②MSCs+cytomix，③MSCs+AT-Ⅱ細(xì)胞，④AT-Ⅱ cells+ cytomix。下小室培養(yǎng)MSCs，或在上小室內(nèi)培養(yǎng)AT-Ⅱ。共培養(yǎng)48小時(shí)取培養(yǎng)基上清，利用ELISA方法測(cè)定KGF的分泌。利用lipof

8、ectamine2000為載體轉(zhuǎn)染KGF-SiRNA，在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后測(cè)定KGF分泌水平，了解SiRNA的干擾效率。Cytomix包括TNF-α、IL6和IL1-β等炎癥因子。
　　6.MSCs靜脈注入大鼠肺內(nèi)示蹤:利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(10mg/kg)經(jīng)鼠尾靜脈注射構(gòu)建大鼠ALI模型，4h后經(jīng)鼠尾靜脈注射DiI標(biāo)記的MSCs(5×105)。MSCs注射后15min，2h，24h and72h

9、分別麻醉并處死大鼠，獲取肺組織，利用小動(dòng)物成像技術(shù)分析MSCs注射大鼠體內(nèi)后肺內(nèi)留存。同時(shí)制作15min，24h and72h時(shí)間點(diǎn)的肺組織冰凍切片，了解MSCs在注射大鼠肺組織后肺內(nèi)分布。
　　7.病理評(píng)價(jià)及肺濕/干比:7-8周的大鼠隨機(jī)分配成6組，第一組大鼠注射PBS液;第二組注入LPS，4h后注射PBS;第三組注射LPS，4h后注射MSCs;第四組注射LPS，4h后注射KGF-SiRNA;第五組注射LPS，4h后注射lipo

10、fectamine2000;第六組注射MSCs。72h后麻醉并處死大鼠并獲取肺組織，右側(cè)肺葉制作石蠟切片并HE染色，左肺葉測(cè)濕/干重。
　　8.α1和β1亞基的蛋白及基因分析:建立體外共培養(yǎng)體系，體外實(shí)驗(yàn)條件如下:AT-Ⅱ細(xì)胞+PBS（對(duì)照組），炎癥攻擊AT-Ⅱ cells+PBS，3）AT-Ⅱ細(xì)胞+MSCs，4）炎癥攻擊AT-Ⅱ細(xì)胞+MSCs，5）炎癥攻擊AT-Ⅱ細(xì)胞+MSCs(KGF-siRNA)，6)炎癥攻擊AT-Ⅱ細(xì)胞+M

11、SCs-lipof。模擬炎癥環(huán)境TNF-α、IL6and IL1-β(1.7ng/ml，87.6ng/ml and4.4ng/ml)。共培養(yǎng)72h后分別應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western blot)及實(shí)時(shí)定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(quantitativepolumerase chain reaction，qPCR)分析Na-K-ATPaseα1和β1亞基的改變。
　　9.PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路分析:為進(jìn)一步分析MSCs修復(fù)AT-

12、Ⅱ的可能機(jī)制。通過(guò)Western blot分析MSCs與AT-Ⅱ cells共培養(yǎng)后AT-Ⅱ的蛋白p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR改變。
　　10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，所有數(shù)據(jù)表達(dá)為X±SD，采用SPSS13.0分析軟件。單組計(jì)量資料采用采用one-sample t test;3組以上獨(dú)立樣本采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進(jìn)一步多重比較采用LSD;重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，

13、P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠BM-MSC在培養(yǎng)皿呈貼壁、成纖維樣生長(zhǎng)。3-8代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CD29，CD44，CD90和CD105，陰性表達(dá)CD34 andCD45。BM-MSC從單個(gè)細(xì)胞到克隆形成，提示其自我復(fù)制能力。脂肪誘導(dǎo)及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后鑒定呈陽(yáng)性。肺二型上皮細(xì)胞經(jīng)分離培養(yǎng)后呈現(xiàn)圓形、鋪路石樣貼壁生長(zhǎng)。經(jīng)肺泡表面活性物質(zhì)A(surfactant protein

14、 A，SP-A)抗體標(biāo)記，免疫熒光檢測(cè)呈陽(yáng)性表達(dá)。
　　2.CCK-8方法測(cè)定AT-Ⅱ細(xì)胞在炎癥損傷后，細(xì)胞增殖呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì);AT-ⅡⅡ與MSCs經(jīng)共培養(yǎng)后細(xì)胞增殖呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。提示MSCs通過(guò)旁分泌作用促進(jìn)AT-Ⅱ細(xì)胞的增殖。
　　3.MSC在無(wú)血清DMEM/F12條件下培養(yǎng)48小時(shí)檢測(cè)KGF濃度為437.65 pg/ml，炎癥刺激后KGF濃度為884.17 pg/ml;當(dāng)MSCs與AT-Ⅱ細(xì)胞共培養(yǎng)條件下KGF濃度為38

15、2.37 pg/ml;AT-Ⅱ分泌KGF濃度明顯較少。說(shuō)明在二者的共培養(yǎng)體系內(nèi)MSCs是KGF的主要來(lái)源。使用cy5標(biāo)記的SiRNA轉(zhuǎn)染MSCs，結(jié)果提示大多數(shù)MSCs被成功轉(zhuǎn)染SiRNA。MSCs被轉(zhuǎn)染KGF-SiRNA后，KGF的分泌明顯降低。
　　4.DiI標(biāo)記MSCs經(jīng)鼠尾靜脈注入大鼠體內(nèi)。小動(dòng)物成像技術(shù)觀察注射后15min肺內(nèi)有大量的MSCs存留，但在2h和24h時(shí)間點(diǎn)MSCs在肺內(nèi)逐步減少，72h肺內(nèi)依然有MSCs留存

16、，但細(xì)胞光強(qiáng)值明顯下降。冰凍切片提示注射后15min肺內(nèi)MSCs呈聚集現(xiàn)象，在24h與72h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞在肺內(nèi)散在分布，在肺泡內(nèi)可見(jiàn)DiI標(biāo)記的MSCs。
　　5.大鼠鼠尾靜脈注射LPS病理結(jié)果提示肺泡內(nèi)炎性滲出和肺泡間隔增厚。注射MSCs后肺泡炎性滲出液減少和肺泡間隔變小。KGF-SiRNA轉(zhuǎn)染MSC后，MSC的治療作用減弱。肺組織濕/干比在大鼠注入LPS后升高。繼LPS鼠尾靜脈注入MSCs濕/干下降，LPS后大鼠注入KGF-Si

17、RNA轉(zhuǎn)染的MSCs，濕/干比上升。
　　6.α1和β1亞基在炎癥因子損傷下，在蛋白和基因水平二者的表達(dá)均下降。
　　結(jié)論:
　　1.MSCs在炎性條件比非炎性條件分泌更多的KGF。DiI標(biāo)記的MSCs注入大鼠體內(nèi)，早期肺內(nèi)留存較多，后逐步下降，在注射后72后MSCs在肺內(nèi)依然有存留。
　　2.大鼠注入LPS后肺內(nèi)炎性滲出增加，濕/干比升高，注入MSCs后肺泡內(nèi)液體消失，濕/干比重下調(diào)，MSC可能通過(guò)促進(jìn)AFC的