象草MYB4轉錄因子及CCR啟動子的克隆與功能分析.pdf

1、象草（Pennisetum purpureum）是一種禾本科狼尾草屬多年生草本植物，是熱帶和亞熱帶地區(qū)的重要種質資源。但植株體內高含量的木質素限制了象草的開發(fā)和利用。因此，通過基因工程的手段，對植株進行木質化遺傳改良對象草的利用具有非常重要的意義。MYB轉錄因子可以在轉錄水平上參與木質素的合成調控。本研究克隆了象草MYB轉錄因子，并且對其進行了功能分析，同時還克隆了肉桂酰輔酶A還原酶基因（Cinnamoy-CoA Reductase,C

2、CR）啟動子，分析了其表達特性，以期為象草的木質化改良工作奠定基礎。主要的研究結果如下：
　　（1）通過同源克隆的技術，從華南象草中克隆出一個756 bpMYB轉錄因子CDS區(qū)域，命名為PpMYB4。序列已經提交GenBank，登錄號為：KU612217。
　?。?）通過軟件分析，PpMYB4含有251個氨基酸，蛋白質分子式為C1217H1954N362O356S17。總分子量為27.89KDa，理論等電點（PI）為8.81

3、。不穩(wěn)定系數是45.45，屬于不穩(wěn)定蛋白，親水性平均值（GRAVY）為-0.468，為親水性蛋白，定位于細胞核中。PpMYB4的氨基酸序列中含有2個保守的結構域，在系統進化樹中與單子葉植物R2R3-MYB轉錄因子歸為一類。
　?。?）構建一個以eGFP為報告基因的亞細胞定位載體pAN580-PpMYB4，通過PEG介導法轉化象草原生質體后發(fā)現PpMYB4定位于細胞核中。
　　（4）構建了PpMYB4的植物過表達載體pBA-P

4、pMYB4，并且通過葉盤法轉化煙草，最終得到7株陽性轉基因株系。與野生型相比，轉基因植株生長緩慢，出現矮化、莖節(jié)變短、老葉早衰、葉形不正常等現象。轉基因煙草莖部的木質素含量與野生型植株相比顯著下降，其中OE6植株的木質素含量比野生型植株木質素含量低32.45％。該結果說明PpMYB4基因參與了木質素合成的負調控。
　?。?）對轉基因植株木質素合成途徑中關鍵酶基因進行Real-time PCR檢測，發(fā)現轉基因植株的木質素合成關鍵酶基

5、因PAL、C4H、CAD、CCoAOMT、HCT的相對表達量分別為0.49、0.38、0.71、0.30、0.45，比野生型植株表達量低，且PAL、C4H和CAD表達量顯著低于野生型植株。該結果說明過量表達 PpMYB4使得植株的木質素合成關鍵酶基因的改變從而引起植株木質素含量的改變。
　?。?）通過hiTAIL-PCR的方法克隆了華南象草PpCCR基因起始密碼子ATG上游1368 bp的啟動子序列。經過預測，該序列的轉錄起始位點

6、（TSS）為T，位于ATG上游261 bp處。PpCCR啟動子含有重要的順式作用元件TATA-box和CAAT-box。PpCCR啟動子的其他順式作用元件還可以分為3類。一類是對植物生長發(fā)育相關的元件，如光響應元件、分生組織表達相關的元件（CAT-box）、胚乳表達相關的元件（GCN4_motif）、植物生物鐘調控的作用元件（Circadian）。另外一類主要是對外源激素脅迫響應的元件，如 CGTCA-motif、TGACG-motif

7、為茉莉酸甲酯響應的元件，TGA-element為生長素響應的元件，motif IIb為脫落酸的響應元件。還有一類調控元件為MYB轉錄因子的識別位點。
　　（7）構建PpCCR啟動子-GUS表達載體并且通過葉盤法轉化煙草。對轉基因植株莖、葉柄、葉和根進行 GUS組織化學染色發(fā)現，植株葉柄的木質部和韌皮部以及莖部的維管組織細胞能被染成藍色；葉片和根部不能染成藍色。以上結果說明PpCCR啟動子是一個典型的維管組織特異型啟動子。利用200