水稻組織特異表達啟動子的分離克隆、功能分析及應用.pdf

1、高等植物的生長發(fā)育是不同基因在時間和空間上有序表達和協(xié)同作用的過程。啟動子作為轉(zhuǎn)錄水平上一個重要的調(diào)控元件，通過和眾多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合進而決定了基因的表達模式與表達強度。深入研究啟動子的結(jié)構、功能、作用模式等對于回答分子生物學中的一些基本理論問題具有重大意義。如何讓外源基因在植物體內(nèi)定向、高效、穩(wěn)定的表達是植物基因工程研究的出發(fā)點和落腳點。用組織特異表達啟動子來驅(qū)動目的基因表達可有效的避免用組成型表達啟動子所帶來的一些諸如代謝負擔之類的負

2、面效應。但是目前調(diào)控機理清楚且可用于作物遺傳改良的組織特異表達啟動子仍然較少。
　　 水稻是非常重要的糧食作物之一，亦是功能基因組學研究的模式植物。本研究的目的就是從水稻中分離克隆組織器官特異表達啟動子，分離鑒定起關鍵調(diào)控作用的順式元件，為轉(zhuǎn)基因水稻育種服務，為長遠的啟動子改造和設計儲備資源。本研究獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.構建改造5個專門用于水稻啟動子克隆及功能驗證的載體：DX2181、DX2181S、DX218

3、1G、DX2181Smini46和DX2181Smini89。
　　 2.利用RT-PCR的辦法對基于芯片數(shù)據(jù)挑選出的胚乳特異表達候選基因En2做進一步表達模式鑒定。分離克隆En2的啟動子EnP2，將其與報告基因GUS融合，轉(zhuǎn)基因結(jié)果證明EnP2為胚乳特異表達啟動子。5’系列缺失證明，155bp的長度的啟動子(EnP2-155)就足以維持胚乳特異表達模式。
　　 3.利用RT-PCR的辦法對基于芯片數(shù)據(jù)挑選出的胚乳特異表

4、達候選基因En3做進一步表達模式鑒定。分離克隆En3的啟動子EnP3，轉(zhuǎn)基因結(jié)果證明EnP3為胚乳特異表達啟動子。5’系列缺失證明，126bp長度的區(qū)域(從啟動子EnP3-292到EnP3-166之間的區(qū)域)對于維持EnP3-292胚乳特異表達模式是至關重要的。突變分析發(fā)現(xiàn)順式作用元件“2SSEEDPROTBANAPA”和“GCN4-like motif”以負向調(diào)控元件身份來對EnP3-292胚乳特異表達模式進行調(diào)控，但并不影響啟動子在

5、胚乳中的表達模式與強度。
　　 4.利用RT-PCR的辦法對基于芯片數(shù)據(jù)挑選出的綠色組織特異表達候選基因DX1做進一步表達模式鑒定。分離克隆DX1的啟動子PDX1，轉(zhuǎn)基因結(jié)果證明PDX1為綠色組織特異表達啟動子。5’及3’系列缺失證明-195至-22和+1至+86這兩個區(qū)域直接決定啟動子PDX1的活性，凝膠阻滯實驗在這兩個區(qū)域分別鑒定出綠色組織特異表達順式作用元件GSE1和GSE2。突變分析發(fā)現(xiàn)GSE1和GSE2都是作為正向調(diào)控

6、元件來的行使功能的，GSE1可以同時調(diào)控所有綠色組織(葉片、葉鞘、莖桿和穗)基因的表達且影響作用較大，而GSE2只能調(diào)控葉鞘和莖桿這兩個組織基因的表達且影響作用較微弱。
　　 5.用根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導的遺傳轉(zhuǎn)化法，將粳稻品種“日本晴”來源的rbcS基因啟動子驅(qū)動下的cryl C*基因?qū)刖酒贩N中花11，結(jié)合Southern blolting檢測、純合陽性株系篩選、田間抗性評價、農(nóng)藝性狀考察及CrylC*蛋白測定，最終從47