化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的克隆、定點(diǎn)突變及功能分析.pdf

1、調(diào)控基因表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)在基因功能鑒定及植物生物工程方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值.植物受到病原菌侵染后,感染部位產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng),在其它部位產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性并伴隨抗性基因包括病程相關(guān)蛋白(Pathogen-Related protein)基因的表達(dá).其中一個(gè)PR基因PR-1a,不僅受病原菌誘導(dǎo),而且受一些化學(xué)劑如SA、BTH等化學(xué)劑的誘導(dǎo),其誘導(dǎo)應(yīng)答由其啟動(dòng)子控制,因此PR-1a啟動(dòng)子可以應(yīng)用于植物化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)中.根據(jù)PR-1a基因的報(bào)

2、道序列,設(shè)計(jì)兩對引物,以煙草基因組為模板,通過PCR擴(kuò)增得到900bp(IPl)和603bp(IPs)兩個(gè)目標(biāo)片段,序列測定表明克隆的啟動(dòng)子與報(bào)道序列具有99％的同源性,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、TATA box及保守序列TGAC與報(bào)道序列均完全相同.通過PCR方法對克隆的兩個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行定點(diǎn)突變,使轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-137bp處A突變?yōu)镃,得到兩個(gè)突變啟動(dòng)子(IPMl、IPMs).將花藥盒元件插入突變位點(diǎn),得到兩個(gè)修飾的化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子(IPMal、

3、IPMas).為了檢測得到的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)效率及誘導(dǎo)活性,將所得到的啟動(dòng)子、定點(diǎn)突變啟動(dòng)子和插入花藥盒的啟動(dòng)子與GUS基因連接,構(gòu)建了6個(gè)植物表達(dá)載體,同時(shí)分別構(gòu)建包含IPl::barnase、IPMl::barnase、IPMal::barnase嵌合基因的植物表達(dá)載體.將前6個(gè)表達(dá)載體導(dǎo)入煙草,得到大量經(jīng)Southern雜交驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因植株.用SA和BTH處理轉(zhuǎn)基因煙草植株誘導(dǎo)GUS基因的表達(dá),結(jié)果表明:1.全長900bp啟動(dòng)子能夠應(yīng)答

4、SA和BTH的誘導(dǎo),而603bp長的啟動(dòng)子無論突變與否對SA和BTH均無應(yīng)答,證明SA和BTH的應(yīng)答區(qū)域在克隆啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游575~872bp之間.2.在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游137bp定點(diǎn)將A突變?yōu)镃后,對化學(xué)啟動(dòng)子的化學(xué)誘導(dǎo)應(yīng)答性沒有明顯的影響,但對誘導(dǎo)效應(yīng)的向上運(yùn)輸存在一定程度的阻抑作用.3.在克隆的化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子中適當(dāng)位點(diǎn)插入花藥盒可以使誘導(dǎo)應(yīng)答集中于花藥,從而使天然的化學(xué)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子變成人工花藥特異性啟動(dòng)子.4.化學(xué)誘導(dǎo)劑B

5、TH的誘導(dǎo)效率高于SA,且在有效誘導(dǎo)濃度范圍內(nèi)對植株沒有生理毒性或所產(chǎn)生的生理毒性難以從表象觀察到.5.BTH能系統(tǒng)誘導(dǎo)PR-1a野生型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株的葉、花藥、萼片及成熟花粉中表達(dá),而SA的誘導(dǎo)作用則具有某種時(shí)空局限性.6.BTH在葉片中系統(tǒng)誘導(dǎo)時(shí)間為施藥后的15天,誘導(dǎo)作用可以持續(xù)25天以上,而且誘導(dǎo)效應(yīng)沿主莖上下運(yùn)輸,而SA僅誘導(dǎo)處理部位的基因表達(dá).7.1.2mM以下濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加,SA在植株中的運(yùn)輸