番茄SlNAM1轉(zhuǎn)錄因子的分離與功能分析.pdf

1、低溫是植物地理分布和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要限制因素，低溫脅迫包括冷害（<10℃）和凍害（<0℃）兩種。低溫能夠直接抑制植物正常的生理代謝，造成植物生長(zhǎng)發(fā)育的延緩或阻滯；低溫導(dǎo)致光合速率下降，光合作用產(chǎn)物的形成、分配及轉(zhuǎn)運(yùn)均受到影響；低溫會(huì)抑制水分的吸收，誘導(dǎo)產(chǎn)生次生的脫水和滲透脅迫；同時(shí)，低溫還會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），對(duì)生物大分子及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)造成破壞。番茄等喜溫蔬菜經(jīng)歷低溫時(shí)，自身不能完

2、成冷馴化（Cold acclimation），因此其農(nóng)業(yè)生產(chǎn)易受低溫的影響。
　　NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族。大多數(shù)NAC轉(zhuǎn)錄因子都是誘導(dǎo)表達(dá)型的，在植物不同發(fā)育階段以及非生物脅迫和生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。番茄中的NAC轉(zhuǎn)錄因子多達(dá)102個(gè)，但功能大部分是未知的。本實(shí)驗(yàn)從番茄中分離得到了一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子（SlNAM1），并以過(guò)表達(dá) SlNAM1的轉(zhuǎn)基因煙草為材料，研究了SlNAM1對(duì)煙草低溫抗性的影響，對(duì)

3、于闡明NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物低溫響應(yīng)的機(jī)制具有十分重要的科學(xué)意義。本研究主要結(jié)果如下：
　?。?）根據(jù)NCBI中已知的SlNAM1基因序列（GenBank注冊(cè)號(hào)：NM_001247290），利用DNAMAN設(shè)計(jì)特異引物，以番茄cDNA為模板，利用PCR反應(yīng)獲得SlNAM1全長(zhǎng)。SlNAM1基因全長(zhǎng)1218bp，開放閱讀框長(zhǎng)891bp，編碼296個(gè)氨基酸。
　?。?）在煙草中瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)SlNAM1-GFP融合蛋白產(chǎn)物，

4、并利用激光共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)綠色熒光只存在于細(xì)胞核中，說(shuō)明SlNAM1定位于細(xì)胞核；利用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè) SlNAM1的轉(zhuǎn)錄激活活性，發(fā)現(xiàn)其 C端具有轉(zhuǎn)錄激活活性，說(shuō)明SlNAM1作為轉(zhuǎn)錄因子行使功能。
　　（3）通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）對(duì) SlNAM1在番茄中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)受4℃、PEG、NaCl、ABA和MeJA等多種脅迫和激素處理的誘導(dǎo)；組織特異性表達(dá)分析結(jié)果表明

5、SlNAM1在葉片中表達(dá)量最高。
　?。?）構(gòu)建pBI121-SlNAM1真核表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，獲得過(guò)表達(dá)SlNAM1的轉(zhuǎn)基因煙草，利用PCR、qRT-PCR篩選得到轉(zhuǎn)基因煙草，并選取OE-7、OE-10和OE-10進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　?。?）正常條件下，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草生長(zhǎng)情況一致，并能正常的開花結(jié)籽。低溫脅迫下，與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草具有更高的種子萌發(fā)率、較低的失水萎蔫程度和更高的凈光合

6、速率。
　?。?）低溫脅迫下，煙草體內(nèi)的活性氧積累急劇上升。與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因植株活性氧積累量明顯較低，SOD和APX等抗氧化酶活性均高于野生型煙草；利用qRT-PCR對(duì)抗氧化酶合成關(guān)鍵基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因植株中的抗氧化酶表達(dá)量上調(diào)程度高于野生型，因此，我們認(rèn)為轉(zhuǎn)基因煙草通過(guò)上調(diào)抗氧化酶的合成來(lái)維持較高的抗氧化酶活性。同時(shí)，低溫脅迫下，煙草中MDA含量和REL上升，細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降。與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)