枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子的克隆及功能分析.pdf

1、枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛應(yīng)用于蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)，是重要的工業(yè)菌種?？莶菅挎邨U菌具有分泌蛋白能力強(qiáng)、非致病性、同時(shí)易于分離培養(yǎng)，遺傳背景較清晰等特點(diǎn)，在基因工程是一種表達(dá)和分泌外源蛋白的理想宿主。實(shí)踐表明目前枯草芽孢桿菌的載體系統(tǒng)常用的啟動(dòng)子不能滿足越來(lái)越多外源基因表達(dá)的要求，因此篩選新型強(qiáng)啟動(dòng)子或者通過(guò)改造啟動(dòng)子以期實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)。
　　利用本研究所構(gòu)建的探針型質(zhì)粒載體PUC-kana直接在大腸

2、桿菌中篩選啟動(dòng)子，并獲得了具有啟動(dòng)子活力的PK3片段，以麥芽糖α-淀粉酶基因sva為報(bào)告基因構(gòu)建pHCMC04-Pk3-sva重組質(zhì)粒，導(dǎo)入B.subtilis1A857菌株中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果表明PK3片段在枯草芽孢桿菌中能使sva基因成功表達(dá)，通過(guò)測(cè)定胞外發(fā)酵液粗酶活力為27.3 U/mL。
　　為了研究人工雙啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄功能，利用來(lái)自枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的啟動(dòng)子PaprE和胞苷脫氨酶(cdd)基因的啟動(dòng)子P43，分別構(gòu)建了麥芽

3、糖α-淀粉酶sva基因?yàn)閳?bào)告基因的pHCMC04-PaprE-sva、pHCMC04-P43-sva、pHCMC04-P43-PaprE-sva和pHCMC04-PaprE-p43-sva表達(dá)載體，然后分別轉(zhuǎn)化B.subtilis1A857感受態(tài)細(xì)胞，不同時(shí)間取樣測(cè)定麥芽糖α-淀粉酶sva酶活并比較其酶活力，結(jié)果顯示重組菌B.subtilispHCMC04-PaprE-sva、 pHCMC04-p43-sva、pHCMC04-P43-P

4、aprE-sva和pHCMC04-PaprE-P43-sva表達(dá)的sva酶活分別為69.4 U/mL，79.7U/mL，97.6 U/mL，121.8 U/mL，菌體密度OD600值分別為8.6、9.03、9.5、9.3。表明雙啟動(dòng)子較單個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)量均有所提高，串聯(lián)組合P43-PaprE較單啟動(dòng)子提高1.2倍，串聯(lián)順序?yàn)镻aprE-p43酶活較單個(gè)啟動(dòng)子提高1.6倍，串聯(lián)組合P43-PaprE與單個(gè)啟動(dòng)子相比差距不顯著，PaprE-p

5、43組合效果最佳。相較于組成型啟動(dòng)子而言，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子具有可控性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，適合用于對(duì)表達(dá)調(diào)控要求嚴(yán)格的外源基因表達(dá)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，嘗試獲得更高效的誘導(dǎo)型表達(dá)載體。以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的pHCMC04-Pglv-sva為骨架，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHCMC04-P43-Pglv-sva和pHCMC04-Pglv-p43-sva分別轉(zhuǎn)化到B.subtilis1A857感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。結(jié)果顯示，添加1.5％麥芽糖后，重組菌pHCMC04-Pg