登革病毒NS1蛋白及其抗體在重癥登革發(fā)病機(jī)制中作用的初步研究.pdf

1、全球受到登革病毒(Dengue virus，DENV)感染威脅的人群近39億，我國(guó)近年感染率增高，僅廣東省2014年就達(dá)45000例。登革病毒有4個(gè)血清型，主要致自限性的登革熱(Dengue Fever，DF)，少數(shù)情況下可出現(xiàn)登革出血熱與登革休克綜合征（DHF/DSS），約占DF患者的5％～10％，發(fā)生率雖低但死亡率高。目前對(duì)致命性的DSS的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，若干可能的原因，如抗體依賴(lài)增強(qiáng)效應(yīng)(ADE)，細(xì)胞因子風(fēng)暴，補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒

2、反應(yīng)等。近年人們開(kāi)始關(guān)注登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1(DENV-NS1)及其抗體在DHF/DSS的發(fā)病機(jī)制中的作用。因重癥登革患者的血清常含有較高濃度的NS1蛋白及相應(yīng)的IgG抗體水平，我們關(guān)注非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)與其IgG型抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物能否引起休克;此外，DHF的發(fā)生可能因NS1蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生與血小板等血液系統(tǒng)細(xì)胞交叉識(shí)別的抗體，導(dǎo)致血小板減少并引起出血。
　　基于本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期在登革血清學(xué)診斷方面的關(guān)注積累，尤其是制備

3、并保存了針對(duì)4個(gè)血清型NS1的148株單抗，本文分別對(duì)重癥登革的DSS與DHF，即休克與出血兩個(gè)方面的機(jī)制做了初步的探索。
　　第一章 IgG型抗登革病毒NS1抗體介導(dǎo)被動(dòng)系統(tǒng)過(guò)敏反應(yīng)的研究
　　通過(guò)超濾制備濃縮病毒上清，以親和層析法獲得純化DENV1 NS1，并分別與20株IgG型抗DENV1 NS1單抗或單抗組合孵育制備免疫復(fù)合物，然后分別攻擊小鼠，建立被動(dòng)系統(tǒng)性過(guò)敏反應(yīng)(passive systemic anaphyl

4、axis，PSA)和被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)(passive cutaneous anaphylaxis，PCA)模型;并觀察體內(nèi)氯化釓(GdCl3)和血小板活化因子受體(platelet activating factor receptor，PAFR)拮抗劑CV-3988處理對(duì)PSA的影響。結(jié)果顯示只有5D25+3B1和5D25+3C65兩個(gè)IgG型單克隆抗體組合可以誘發(fā)PSA與PCA;用GdC13抑制單核巨噬細(xì)胞或CV-3988阻斷PAFR

5、處理可抑制或減輕小鼠PSA反應(yīng)。證明DENV1 NS1結(jié)合兩個(gè)IgG型單抗組合的免疫復(fù)合物可誘發(fā)PSA與PCA，這種過(guò)敏途徑由免疫復(fù)合物啟動(dòng)，以PAF為主要效應(yīng)介質(zhì)，以單核/巨噬細(xì)胞為主要的效應(yīng)細(xì)胞。推測(cè)這是發(fā)生重癥登革休克綜合癥(DSS)可能的機(jī)制之一。
　　第二章 抗登革病毒NS1抗體的血小板結(jié)合特性研究
　　我們從約113株抗NS1單抗中通過(guò)間接ELISA、流式細(xì)胞術(shù)以及免疫印跡技術(shù)篩選鑒定共獲得能結(jié)合人血小板的抗DE