抗鵝細小病毒NS1蛋白單克隆抗體的制備及其對應抗原表位區(qū)分析.pdf

1、小鵝瘟（Gosling plague，GP）是由細小病毒科、依賴病毒屬中的鵝細小病毒（Goose Parvovirus，GPV）引起的一種烈性傳染病。主要侵害4日齡至20日齡內的雛鵝和雛番鴨，可以引起急性腸炎及肝、腎、心等實質臟器敗血性病變，尤其以小腸部位的纖維性、栓塞性病變?yōu)橹饕卣?，發(fā)病率和死亡率可高達90％以上。目前，此病每年都有不同程度的流行，是養(yǎng)鵝及番鴨地區(qū)最主要的傳染病之一，造成了嚴重的經濟損失。由于本病長期困擾著養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)

2、展，所以需要一種能夠準確、簡便的診斷方法來對該病作出早期診斷。鵝細小病毒NS1蛋白（GPV-NS1）是鵝細小病毒的主要非結構蛋白，通過單克隆抗體技術對GPV-NS1抗原表位進行研究，不僅有助于了解其抗原結構的功能，而且為建立以表位為基礎的抗原抗體診斷方法提供了必要的物質材料支持，以期對該病做出早期的診斷。
　　 本研究首先構建了真核表達載體pcDNA3.1-GPV-NS1，同時構建了帶有表達載體pET30a(+)的重組GPV-N

3、S1，并在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中進行了表達，利用GPV感染鵝的血清（GPV活疫苗毒免疫10周的鵝血清）對表達產物進行Western blot分析，證實表達的融合蛋白具有較好的免疫原性。然后以重組質粒pcDNA3.1-GPV-NS1及純化重組蛋白GPV-NS1為抗原，分組免疫4-6周齡Balb/c鼠，免疫三次后，取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，利用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞株，并初步研究其部分生物學特性。結果共獲得6株

4、能穩(wěn)定分泌特異性抗體的陽性雜交瘤細胞株。單克隆抗體亞型鑒定結果顯示，2株為IgG2a型，4株為IgM型，輕鏈均為κ鏈。通過間接免疫熒光顯示，4株單抗均與鵝胚成纖維細胞表達的pcDNA3.1-GPV-NS1發(fā)生強熒光信號，進一步證明了單抗的特異性。
　　 Western blot結果表明，所制備的單抗與重組NS1蛋白發(fā)生特異性反應。用本實驗室制備保存的15個相互重疊且覆蓋整個GPV-NS1截短表達的重組蛋白，對抗GPV-NS1的單

5、克隆抗體進行Western blot的鑒定，初步證實了單克隆抗體1B2、3F12和4C6的表位存在于GPV-NS1的498～532aa內；3D9的表位存在于485～532aa內；2D4的表位存在于485～514aa內；3H8的表位存在于543～573aa內。鑒定出3個抗原表位區(qū)，分別位于NS1 485～514aa，498~532aa和543～573aa。
　　 本研究制備了抗GPV-NS1單抗，并對其相應抗原表位區(qū)域進行研究，有