細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在體內(nèi)及體外對(duì)胃癌抑制作用的研究.pdf

1、背景：胃癌是我國(guó)死亡率第三位的惡性腫瘤。傳統(tǒng)分期手術(shù)輔助放化療治療方法療效不肯定，且常伴隨嚴(yán)重的毒副作用。因此探索高效低毒的治療方法有極其重要的意義。細(xì)小病毒是具有選擇性殺傷腫瘤作用的溶瘤病毒，其非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein1，NS1）具有獨(dú)立的抑瘤作用，既往研究報(bào)道 NS1蛋白對(duì)包括胃癌在內(nèi)的多種消化道腫瘤具有確定的抑制作用。本研究將在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討NS1在體內(nèi)體外的抑瘤作用及效應(yīng)機(jī)制，特別是體內(nèi)

2、轉(zhuǎn)染系統(tǒng)性表達(dá)NS1蛋白的抑瘤作用及安全性。
　　第一部分 eGFP-NS1重組基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
　　目的：構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使胃癌細(xì)胞表達(dá)融合蛋白。
　　方法：以前期研究中構(gòu)造的pcDNA3.1(+)-NS1重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增NS1基因片段全長(zhǎng)，經(jīng)瓊脂糖電泳分離酶切產(chǎn)物，回收目的片段，使用XhoI、BamHI

3、雙酶切后插入pEGFP-C1載體中，所得產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行抗性篩選，挑取所得菌落進(jìn)行測(cè)序，攜帶完整NS1的質(zhì)粒被用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。使用脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，設(shè)置空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為陰性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液處理組為空白對(duì)照，檢測(cè)各組目的基因的表達(dá)及熒光信號(hào)表達(dá)。
　　結(jié)果：酶切及測(cè)序結(jié)果顯示NS1基因已完整連接至pEGFP-C1載體中，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表達(dá)NS1基因，胞內(nèi)可檢測(cè)到綠色熒光蛋白信號(hào)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)80％。與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組

4、熒光信號(hào)集中于胞核內(nèi)。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的NS1融合基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可使胃癌細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)融合蛋白。
　　第二部分 NS1蛋白在體外對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用及作用機(jī)制研究
　　目的：體外驗(yàn)證NS1蛋白對(duì)兩種胃癌細(xì)胞的抑制作用，探索其抑瘤效應(yīng)機(jī)制。
　　方法：介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空載體轉(zhuǎn)染組為陰性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液處理組為空白對(duì)照，繪制各組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，根據(jù)

5、生長(zhǎng)曲線計(jì)算間隔24小時(shí)的抑制率。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)胞內(nèi)活性氧基，通過檢測(cè)細(xì)胞衰老β半乳糖苷酶水平研究細(xì)胞衰老狀態(tài)，分析各組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期分布，鑒定周期調(diào)控關(guān)鍵因子蛋白含量及mRNA表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：與陰性對(duì)照及空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制，轉(zhuǎn)染后1-4天SGC7901及MGC80-3細(xì)胞的抑制率分別為45%、62%、73%、77%及73%、88%、93%、95%。表達(dá)EGFP-N

6、S1融合蛋白的細(xì)胞周期停留于G0/G1期，胞內(nèi)p21蛋白在轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后顯著升高，但mRNA水平無明顯改變。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組老化細(xì)胞增多（實(shí)驗(yàn)組(31.1±2.7)%VS陰性對(duì)照組(3.5±3.5)%，p=1.92*10-5），但胞內(nèi)活性氧基水平與對(duì)照組相比并無顯著差異。
　　結(jié)論：NS1蛋白可顯著抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，其機(jī)制或在于誘導(dǎo)胞內(nèi)p21蛋白蓄積并阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期。
　　第三部分裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染eGFP-NS

7、1融合基因?qū)ξ赴┮浦擦龅囊种谱饔眉鞍踩缘难芯?br>　　目的明確體內(nèi)轉(zhuǎn)染 EGFP-NS1融合基因?qū)ξ赴┮浦擦龅囊种谱饔眉皩?duì)重要臟器的影響。
　　方法使用2*107 SGC7901細(xì)胞皮下注射成瘤，待瘤體生長(zhǎng)至0.5*0.5cm大小時(shí)，使用多聚乙酰亞胺介導(dǎo)重組質(zhì)粒（實(shí)驗(yàn)組）或空載體（陰性對(duì)照組）活體瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染，每3天處理一次，共轉(zhuǎn)染6次，空白對(duì)照組于等時(shí)間間隔予等體積生理鹽水瘤內(nèi)注射。使用熒光照相機(jī)檢測(cè)熒光蛋白在小鼠體內(nèi)的表達(dá)，比

8、較各組胃癌移植瘤生長(zhǎng)狀況，觀察轉(zhuǎn)染期間小鼠毒副反應(yīng)。第6次轉(zhuǎn)染后處死小鼠，留取瘤體及肺組織標(biāo)本，測(cè)量瘤體直徑，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)及病理學(xué)檢查，檢測(cè)NS1蛋白的表達(dá)及其對(duì)癌瘤組織及正常組織的影響。
　　結(jié)果空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積分別為(1.98±0.60)cm3、(2.00±0.47)cm3、(0.30±0.12)cm3，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，瘤體大小差異具顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。實(shí)驗(yàn)期間小