重組登革病毒2型NS1蛋白的免疫原性研究及其B細胞表位的篩選、鑒定.pdf

1、研究背景： 登革病毒(Dengue virus，DENV)屬黃病毒科、黃病毒屬的一個血清學亞群，包括四個不同的血清型(DENV1～DENV4)，是能引起人類發(fā)生從自限性類似流感樣綜合癥的登革熱(dengue fever, DF)到嚴重威脅生命的登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever, DHF)及登革休克綜合癥(Dengue shock syndrome，DSS)的病原體。80年代以來，DHF/DSS在世界范

2、圍內(nèi)的流行、爆發(fā)更加頻繁，成為世界上最多見的蟲媒病毒病。近年來，我國南方諸省亦頻發(fā)該病毒的流行，已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。雖然登革病毒感染在全世界范圍內(nèi)播散，但對登革熱尤其DHF/DSS的確切發(fā)病機制仍未闡明，尚缺乏可用的疫苗和特效藥物。 登革病毒為單正鏈RNA病毒，基因組編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。NS1蛋白是登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的糖蛋白，分子量約42～50KDa，常以二聚體形式存在，這種聚合體是維持其功能所必需的。

3、近年研究表明，NS1蛋白在登革病毒致病與機體免疫反應中可能起重要作用，而且在登革病毒感染的診斷及亞單位疫苗的研制等方面也有一定的價值。 研究目的： 本文旨在研究重組DENV2-NS1蛋白的免疫原性，制備兔抗DENV2-NS1多克隆抗體；篩選和鑒定DENV2-NS1蛋白的B細胞優(yōu)勢表位，分析各表位的潛在應用前景，為進一步研究登革病毒NS1蛋白的生物學特性及其在DENV致病與免疫機制中的作用提供基礎(chǔ)。 研究方法：

4、 在本室已成功構(gòu)建的登革病毒2型NS1蛋白畢赤酵母表達系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，利用該系統(tǒng)進行DENV2-NS1蛋白的分泌表達；并免疫新西蘭大白兔，獲得特異性針對DENV2-NS1的高免血清抗體，對抗體進行純化；以純化的多克隆抗體IgG作為靶分子對Ph.D.TM噬菌體展示肽庫進行淘洗，再結(jié)合生物信息學方法，篩選DENV2-NS1蛋白特異性B細胞表位；人工合成表位多抗原肽(MAPs)，ELISA法檢測其免疫反應性、敏感性及競爭抑制率。 結(jié)

5、果： 1.轉(zhuǎn)化子Pichia Pastoris—NS1經(jīng)過復蘇、誘導表達、鑒定和低溫真空凍干，成功獲得重組表達的DENV2-NS1蛋白凍干粉。 2.將重組表達的蛋白對新西蘭大白兔進行免疫，經(jīng)鑒定得到特異性針對DENV2-NS1的高免血清抗體，ELISA測定多克隆抗體的效價為1:6000。對抗體進行純化，最終獲得高度純化的抗體IgG，純化抗體的效價為1：100。 3.采用噬菌體表面展示技術(shù)，以抗DENV2-NS1多

6、克隆抗體為篩選標靶，經(jīng)過4輪生物淘洗，共篩選到7個DENV2-NS1蛋白B細胞表位VASPERPSPAFP、VASPERTSPAFP、EASPERPSPAFP、SSATPNRLTWLL、YSHVHALSTYAR、AAPLGTHPSMHP、LPPLGTHPSMHP，結(jié)合生物信息學分析，人工合成兩條優(yōu)勢表位多抗原肽(MAPs) PESPSKLASA和AIKDNRAVHA，并用ELISA法對其免疫反應性、敏感性及競爭抑制率進行了初步檢測。