自凝聚標(biāo)簽與SPM融合表達(dá)載體的構(gòu)建及重組牛γ干擾素的表達(dá)與純化.pdf

1、重組蛋白純化是蛋白功能研究和藥物研發(fā)的重要環(huán)節(jié)。目前常用的重組蛋白純化方法主要有親和層析法，其純化效率較高，但不僅需用昂貴的親和樹脂、難以規(guī)?；?，而且常需用蛋白酶切除標(biāo)簽蛋白，而蛋白酶不僅價(jià)格昂貴，還需用其他方法將其從終產(chǎn)物中去除，使得重組蛋白純化進(jìn)一步復(fù)雜化和增加額外成本。因此，建立簡單、經(jīng)濟(jì)的重組蛋白純化方法是生物制藥研究領(lǐng)域迫切需要解決的問題，對獸用重組蛋白更是如此。
　　腦膜炎奈瑟球菌FrpC蛋白自加工元件(self-pr

2、ocessing module，SPM)由250個(gè)氨基酸組成，在鈣離子誘導(dǎo)下能進(jìn)行FrpC蛋白Asp414/Pro415位點(diǎn)自體剪切。本課題組將SPM自剪切活性與類彈性蛋白多肽(ELP)的溫度敏感可逆相變特性相結(jié)合，建立了簡單、經(jīng)濟(jì)的重組蛋白表達(dá)與純化方法。自裝配肽(Self-assembling peptide)能在菌體內(nèi)自然形成類似包涵體的結(jié)構(gòu)，但其融合表達(dá)產(chǎn)物具有活性，可用離心法進(jìn)行分離純化。本研究將SPM與自凝聚標(biāo)簽相結(jié)合，建立

3、了更為簡單、經(jīng)濟(jì)的重組蛋白表達(dá)與純化方法，并成功用于牛重組γ干擾素(BoIFNγ)的表達(dá)與純化。
　　將16個(gè)氨基酸組成的β自裝配肽ELK16編碼序列優(yōu)化成大腸桿菌偏愛密碼子序列，N端引入17個(gè)脯氨酸(P)或蘇氨酸(T)組成的PT連接頭。將人工合成的PT16序列插入pET-30a載體。用高保真PCR擴(kuò)增SPM編碼序列，與PT16序列同框融合，構(gòu)建得融合表達(dá)載體pSPM-PT16。將BoIFNγ成熟肽序列插入SPM-PT16融合標(biāo)簽

4、上游，將重組載體pBoIFNΥ-SPM-PT16轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。通過對培養(yǎng)基、IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間等條件的系統(tǒng)優(yōu)化，使融合蛋白獲得有效表達(dá)。通過對離心力、Triton X100洗滌濃度和尿素變性/復(fù)性等條件的優(yōu)化，分離純化的融合蛋白純度達(dá)92.7％，回收率達(dá)70.4％。利用鈣離子誘導(dǎo)融合蛋白自剪切，用離心去除SPM-PT16融合標(biāo)簽，獲得的重組BoIFNγ純度達(dá)94.9％。以水泡性