畢赤酵母表達(dá)的重組人干擾素λ1(IL-29)的表達(dá)、純化及抗腫瘤活性的初步研究.pdf_第1頁(yè)
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1、IFN—λs是最新發(fā)現(xiàn)的一類具有抗病毒活性的干擾素樣細(xì)胞因子,包括IFN—λ1(IL—29)、IFN—λ2(IL—28A)和IFN—λ3(IL—28B)。IFN—λs在基因結(jié)構(gòu)上與IL—10家族十分相似,而在氨基酸組成和功能方面與I型IFN更為接近,在IL—10家族和I型IFN之間建立了進(jìn)化上的聯(lián)系。因此IFN—λ1具有開發(fā)成抗病毒抗腫瘤藥物的潛在價(jià)值。
   本組前期工作中通過(guò)RT—PCR從人外周血淋巴細(xì)胞中克隆了IFN—λ1

2、 cDNA,通過(guò)基因重組及酵母表達(dá)技術(shù),已設(shè)計(jì)并表達(dá)了一種新的重組人干擾素λ1(IL—29)蛋白。前期工作表明,該重組蛋白能夠在畢赤酵母中正確分泌性表達(dá),具有能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞內(nèi)的STAT1磷酸化的生物學(xué)活性。本論文在此基礎(chǔ)上,對(duì)重組人干擾素λ1的表達(dá)純化,理化性質(zhì)鑒定,受體分布和抗腫瘤生物活性幾個(gè)方面進(jìn)行了進(jìn)一步的探索。
   本論文的第一部分工作是使用本組保存的含pA0815—4αF—IFNλ1表達(dá)質(zhì)粒的甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母菌種

3、,通過(guò)BMG培養(yǎng),在BMMY中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),其中低糖基化20kD rhlFN—λ1表達(dá)水平約為9.32mg/L,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SPFF陽(yáng)離子交換層析及Superdex75分子篩層析純化,和HPLC鑒定,獲得較純的重組人IFN—λ1(recombinant humanIFN—λ1,rhIFN—λ1)蛋白。對(duì)純化程序作了產(chǎn)率,純度分析,并對(duì)重組蛋白作了質(zhì)譜,N端測(cè)序,等電點(diǎn)等理化性質(zhì)的鑒定。
   IFN—λs受體隸屬于II型細(xì)胞因子受

4、體家族,由兩個(gè)亞基構(gòu)成,即IL—28R(或稱CRF2—12)和IL—10R2(或稱CRF2—4)。其中IL—28R是IFN—λs受體特有的亞基,CRF2—4最早是作為IL—10受體(IL—10R)的小亞基被發(fā)現(xiàn)的,故又稱為IL—10R2,同時(shí)IL—10R2還是IL—22R和IL—26R的共有亞基。本論文的第二部分工作是通過(guò)RT—PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real—time fluorescent quantitative PCR)方法

5、,對(duì)三個(gè)腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行了IFN—λR復(fù)合物表達(dá)特異性的鑒定。RT—PCR檢測(cè)IL—28R在兩株實(shí)體瘤細(xì)胞株:人宮頸癌細(xì)胞株Hela及人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中均有表達(dá),但在骨髓造血系統(tǒng)來(lái)源的人淋巴瘤細(xì)胞株U937細(xì)胞中未檢測(cè)到表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Hela、HCT116、U937細(xì)胞以各自的GAPDH為參照計(jì)算各自IL—28R基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示,Hela和HCT116細(xì)胞中IFN—λs特異的受體大亞基IL—28R的相對(duì)表達(dá)

6、量遠(yuǎn)高于U937中的相對(duì)表達(dá)量。
   分別以Hela、HCT116及U937細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。MTT比色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IFN—λ1在10、100和1000ng/ml三個(gè)不同濃度對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制率分別為15.20±4.73%,16.57±9.80%和25.88±12.48%:對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制率分別為11.62±10.08%,1.83±2.46%和21.22±6.48%,高于其對(duì)U937細(xì)胞增殖的抑制率11.46±3

7、.48%,13.46±3.83%和8.87±2.73。相反,對(duì)照組IFN—α2a1000IU/ml對(duì)U937細(xì)胞增殖的抑制率20.39±1.24%,高于其對(duì)于Hela和HCT116細(xì)胞增殖的抑制率7.25±1.58%和6.52±1.87%。因此IFN—λ1因其IL—28R表達(dá)水平和組織分布的特異性顯示了與IFN—α差異的抗腫瘤活性。
   上述研究結(jié)果為促進(jìn)IFN—λ1的純化、性質(zhì)、功能的研究打下了基礎(chǔ),對(duì)其由于受體分布特異的原

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