探究顆粒細(xì)胞中miR-26a-b介導(dǎo)雌激素調(diào)控孕酮受體的分子機(jī)制.pdf

1、排卵是雌性哺乳動物中非常重要的生理活動，而這一過程受到許多因素的協(xié)同調(diào)控，其中，由于激素調(diào)節(jié)廣泛性和容易引起級聯(lián)反應(yīng)的特點(diǎn)被認(rèn)為是排卵期主要的調(diào)控因素之一。排卵的正常發(fā)生除了要受到促卵泡激素，黃體化激素的調(diào)節(jié)，還會受到雌激素和孕酮的調(diào)節(jié)。哺乳動物體內(nèi)雌激素和孕酮發(fā)揮生理作用幾乎都要與其特異性受體結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)。在對孕酮受體敲除型小鼠的各項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)孕酮受體表達(dá)異常時，可直接影響雌性哺乳動物的諸多生殖功能的正常進(jìn)行，特別是在排卵這一生理

2、過程中，孕酮受體的正常表達(dá)變得十分重要。近年來，通過RNA-Seq和CHIP-Seq實(shí)驗(yàn)已經(jīng)篩選出了大量孕酮受體的下游基因，其中，過氧化物酶體增生激活受體γ和基質(zhì)金屬蛋白酶1被認(rèn)為是孕酮受體在卵巢中介導(dǎo)排卵過程的關(guān)鍵信號分子。此外，排卵過程中，雌激素和孕酮的血液內(nèi)含量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，是否彼此調(diào)控對方的分泌尚未清楚。同時，雌激素能夠影響細(xì)胞內(nèi)孕酮受體的表達(dá)已得到證實(shí)，但具體的分子機(jī)制還有待研究。
　　隨著雌性生殖研究的深入，大量研

3、究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素含量變化會導(dǎo)致部分miRNA出現(xiàn)差異性表達(dá)。此外，也有實(shí)驗(yàn)證實(shí) miRNA是調(diào)控孕酮受體表達(dá)的諸多要素之一。miR-26a/b是一類常見的哺乳動物miRNA，測序數(shù)據(jù)顯示在卵泡發(fā)育期間的顆粒細(xì)胞中，miR-26a/b維持高水平表達(dá)且在卵泡發(fā)育不同時期存在表達(dá)差異，這一現(xiàn)象說明miR-26a/b可能作為一種重要的調(diào)節(jié)因子參與排卵過程。本實(shí)驗(yàn)擬探究在排卵過程的正常進(jìn)行，是否要依賴于顆粒細(xì)胞中miR-26a/b介導(dǎo)雌激素對孕

4、酮受體的調(diào)控作用。研究結(jié)果顯示，在小鼠原代顆粒細(xì)胞中，經(jīng)雌激素處理24h后，通過RT-PCR檢測pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表達(dá)量都顯著下調(diào)（p≤0.05），此外，通過RT-PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)孕酮受體及其下游基因過氧化物酶體增生激活受體γ和基質(zhì)金屬蛋白酶1的mRNA和蛋白表達(dá)均發(fā)生顯著上調(diào)。通過生物信息學(xué)分析miRNA調(diào)控孕酮受體3’-UTR序列的靶位點(diǎn)序列，構(gòu)建

5、雙熒光報(bào)告載體以及位點(diǎn)突變載體。熒光數(shù)據(jù)顯示，miR-26a/b可特異性結(jié)合到孕酮受體3’-UTR序列，并引起蛋白水平的下調(diào)。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-26a/b可介導(dǎo)雌激素對孕酮受體表達(dá)的調(diào)控，實(shí)驗(yàn)選取了人顆粒細(xì)胞系（KGN）作為實(shí)驗(yàn)對象。KGN細(xì)胞在經(jīng)雌激素處理24h之后，細(xì)胞內(nèi)pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表達(dá)量都顯著下調(diào)（p≤0.05），此外，孕酮受體及其下游基因過氧化物酶體增生激活

6、受體γ和基質(zhì)金屬蛋白酶1的mRNA和蛋白表達(dá)均發(fā)生顯著上調(diào)，結(jié)果與小鼠原代顆粒細(xì)胞處理組一致。通過采用雌激素受體拮抗劑，它莫西芬和雌激素受體干擾RNA，shER阻斷雌激素信號通路，結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表達(dá)量都顯著上調(diào)（p≤0.05），同時孕酮受體及下游基因在mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-26a/b對于下游基因的調(diào)控，實(shí)驗(yàn)中采用miR-26a/

7、b minics和miR-26a/b inhibitors分別處理KGN細(xì)胞，結(jié)果顯示，miRNA minics處理后，孕酮受體及下游基因的表達(dá)受到阻遏；當(dāng)用miRNA inhibitors處理細(xì)胞后，孕酮受體及下游基因的表達(dá)發(fā)生顯著性上調(diào)趨勢。為更加精確模擬miRNA在細(xì)胞內(nèi)的成熟過程，實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建pre-miR-26a/b表達(dá)載體以實(shí)現(xiàn)miRNA在細(xì)胞中長期穩(wěn)定表達(dá)。瞬時轉(zhuǎn)染miRNA表達(dá)載體，可抑制雌激素對孕酮受體的調(diào)控。