MiR-26a在子宮肌瘤發(fā)生過程中的作用及對(duì)雌激素受體α、孕激素受體a的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 子宮肌瘤是婦女疾病中最常見的良性腫瘤，接近一半35-49歲婦女患有子宮肌瘤，源于子宮平滑肌細(xì)胞。經(jīng)常伴隨長期、大量的類似月經(jīng)期的出血，所以會(huì)引起中度貧血。此外，一些病例報(bào)道還會(huì)出現(xiàn)中度到重度的疼痛。子宮肌瘤壓迫導(dǎo)致骨盆不適，腸道和膀胱功能障礙也是非常普遍的現(xiàn)象。更嚴(yán)重的是，會(huì)影響生育，比如不孕及習(xí)慣流產(chǎn)。子宮肌瘤在懷孕期間生長速度非?？?，并有可能引起阻塞分娩被迫進(jìn)行剖腹產(chǎn)，除產(chǎn)后出血外，也可能出現(xiàn)胎兒異常先露和

2、胎兒異常。這些臨床并發(fā)癥嚴(yán)重影響了婦女的健康。
　　 子宮肌瘤是雌激素和孕激素依賴性的良性腫瘤。雖然臨床和生物學(xué)研究一直以來都認(rèn)為雌激素是促進(jìn)子宮肌瘤增長的重要因素，但越來越多的證據(jù)表明孕激素與子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)理也息息相關(guān)。雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)在雌激素介導(dǎo)的致癌過程中都發(fā)生了重要的調(diào)控作用，影響了子宮肌瘤細(xì)胞的生長。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一種大小約21-23個(gè)堿基的非編碼單鏈小分子

3、RNA，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞增殖，凋亡，應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤發(fā)生。最近研究顯示miRNA在多種腫瘤中的表達(dá)水平發(fā)生了變化，可能在某些腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。研究認(rèn)為miRNA水平的變化常導(dǎo)致其靶基因的表達(dá)異常，從而影響了腫瘤的進(jìn)程。許多腫瘤都涉及到了miRNA的變化，并且其變化程度還與腫瘤的分型分級(jí)以及預(yù)后密切相關(guān)，這提示我們?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮重要作用的miRNA極有可能作為腫瘤治療的新型分子靶標(biāo)。
　　 Mir-

4、26a在癌變過程中的作用非常復(fù)雜，它既可作為癌基因，也能夠成抑癌基因，例如其在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和肝癌中作用恰好相反。在這里我們將子宮肌瘤中ERα、PRa的表達(dá)調(diào)控和miRNAs聯(lián)系起來進(jìn)行研究。利用TargetScan分析軟件發(fā)現(xiàn)了mir-26a于ERα、PRa的3'UTR區(qū)存在潛在結(jié)合位點(diǎn)。因此我們選擇mir-26a進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mir-26a對(duì)ERα、PRa表達(dá)的調(diào)控作用并進(jìn)一步揭示其對(duì)子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展的潛在影響。<

5、br>　　 研究方法及結(jié)果：
　　 1、實(shí)時(shí)定量PCR、原位雜交檢測(cè)mir-26a在子宮肌瘤組織和其相應(yīng)子宮肌層組織中的表達(dá)情況：
　　 收集15例子宮肌瘤病人的子宮肌瘤組織和相應(yīng)正常子宮肌層組織，運(yùn)用RealtimePCR檢測(cè)mir-26a在這15例子宮肌瘤和其相應(yīng)子宮肌層組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在13例中，子宮肌瘤組織中的mir-26a呈明顯低表達(dá)。
　　 接著，用形態(tài)學(xué)方法，采用原位雜交檢測(cè)15例子宮肌瘤患

6、者的子宮肌瘤組織和相應(yīng)子宮肌層組織中mir-26a的表達(dá)差異，光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)15例病人標(biāo)本的子宮肌瘤組織中mir-26a表達(dá)均明顯低于其在相應(yīng)子宮肌層組織的表達(dá)。
　　 2、采用免疫組化方法檢測(cè)子宮肌瘤組織及其相應(yīng)正常子宮肌層組織中ERα、PRa和一些周期和增殖指標(biāo)：
　　 隨機(jī)選擇長海醫(yī)院婦產(chǎn)科15例經(jīng)臨床診斷和病理診斷證實(shí)為子宮肌瘤的病人，年齡33～54歲，前一周內(nèi)均未接受雌、孕激素及其它激素治療。采用免疫組化法對(duì)

7、這15例患者的子宮肌瘤組織和相應(yīng)正常子宮肌層組織內(nèi)的ERα、PRa、Ki67、PCNA、CyclinD2和CyclinE2進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在15對(duì)標(biāo)本中，子宮肌瘤組織和其相應(yīng)子宮肌層組織中均含有ERα、PRa、Ki67、PCNA、CyclinD2和CyclinE2，肌瘤組織和肌層組織之間的ERα、PRa、Ki67、PCNA、CyclinD2和CyclinE2四個(gè)檢測(cè)指標(biāo)陽性率均有明顯差別，肌瘤組織中的ERα、PRa、Ki67、PCN

8、A、CyclinD2和CyclinE2均高于相應(yīng)正常肌層組織。
　　 3、培養(yǎng)子宮肌瘤原代細(xì)胞，在細(xì)胞水平驗(yàn)證mir-26a對(duì)ERα、PRa的調(diào)控作用：
　　 用長海醫(yī)院婦產(chǎn)科取得的子宮肌瘤病人新鮮標(biāo)本進(jìn)行原代培養(yǎng)，成功建立人子宮肌瘤細(xì)胞系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。利用TargetScan分析軟件預(yù)測(cè)出ERα、PRa為mir-26a的潛在靶基因，并找出含mir-26a結(jié)合位點(diǎn)的ERα、PRa的3’UTR區(qū)片段，分別克隆插入結(jié)

9、構(gòu)質(zhì)粒PmirGLO的綠色熒光蛋白編碼區(qū)下游，構(gòu)建出新的報(bào)告基因載體。引入雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證出ERα、PRa為mir-26a的靶基因。
　　 在此基礎(chǔ)上，將mir-26a的mimics轉(zhuǎn)入子宮肌瘤細(xì)胞中，使其高表達(dá)mir-26a，并設(shè)立對(duì)照，即轉(zhuǎn)染NC的子宮肌瘤細(xì)胞。用westernblot檢測(cè)mir-26a的靶蛋白ERα、PRa的表達(dá)水平，與對(duì)照相比，mir-26a的mimics轉(zhuǎn)染量不同，ERα、PRa的蛋

10、白水平不同程度下調(diào)。
　　 4、Mir-26a對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞周期和增殖的調(diào)節(jié)：
　　 為證實(shí)mir-26a對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，我們將mir-26a的mimics轉(zhuǎn)入子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞中，使其高表達(dá)mir-26a，并設(shè)立對(duì)照，即轉(zhuǎn)染NC的子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)在24h和48h時(shí)細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)在24h時(shí)，高表達(dá)mir-26a的細(xì)胞與對(duì)照組相比，細(xì)胞大量滯留在G0/G1期。此外，用cck-8

11、試劑盒檢測(cè)mir-26a對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示細(xì)胞種植后的第二天開始，高表達(dá)mir-26a的肌瘤平滑肌細(xì)胞增殖速度顯著慢于對(duì)照組細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 1、子宮肌瘤組織中mir-26a的表達(dá)下調(diào)，揭示mir-26a的表達(dá)與子宮肌瘤之間具有相關(guān)性；
　　 2、較其相應(yīng)的正常肌層組織，子宮肌瘤組織中ERα、PRa、Ki67、PCNA、CyclinD2和CyclinE2表達(dá)水平均升高，所以mir-26a和ERα

12、、PRa、Ki67、PCNA、CyclinD2和CyclinE2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示ERα、PRa、Ki67和PCNA、CyclinD2和CyclinE2的表達(dá)失調(diào)參與子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)；
　　 3、成功建立子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步研究子宮肌瘤的功能奠定基礎(chǔ)；
　　 4、構(gòu)建出含有與mir-26a互補(bǔ)位點(diǎn)的ERα、PRa的3’UTR區(qū)的新報(bào)告基因質(zhì)粒，
　　 并證實(shí)mir-26a參與ERα、

13、PRamRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控；
　　 5、高表達(dá)mir-26a的子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞，ERα、PRa的蛋白水平下調(diào)，mir-26a顯著抑制了ERα、PRa的蛋白表達(dá)量，進(jìn)而有效抑制雌激素、孕激素對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的促增殖作用，提示mir-26a可能成為一項(xiàng)重要的臨床檢測(cè)指標(biāo)；
　　 6、mir-26a的表達(dá)水平與子宮肌瘤的增殖和周期密切相關(guān)，高表達(dá)mir-26a使子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞周期被阻滯，增殖速度降低，抑制了細(xì)胞的分裂