miR-1275靶向NR5A2調(diào)控豬卵泡雌激素生成和顆粒細(xì)胞凋亡.pdf

1、對雌性動物而言，每一個繁殖周期都會有無數(shù)的卵泡生長，但99％以上的卵泡在排卵前都會發(fā)生閉鎖，而卵泡閉鎖的本質(zhì)就是卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。因此研究卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，對提高雌性動物的繁殖性能、延長雌性動物的生育期具有重要的理論意義。miRNA是一類長度為19-25bp的單鏈非編碼RNA，近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA在動物卵泡顆粒細(xì)胞增殖、凋亡以及分化等過程都起著重要的作用，但關(guān)于豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的miRNA調(diào)控機(jī)制研究較少。本實驗室在分析豬卵泡

2、閉鎖過程中miRNA表達(dá)譜時發(fā)現(xiàn)miR-1275在豬卵泡閉鎖過程中表達(dá)極顯著上調(diào)。為了進(jìn)一步研究miR-1275在卵泡閉鎖過程中的作用和調(diào)控機(jī)制，本研究以豬卵泡顆粒細(xì)胞為研究對象，分析其在豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和雌激素合成中的作用。研究結(jié)果對揭示miR-1275在豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖中的作用，闡明豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖的分子機(jī)制均具有重要的意義。本文的主要研究結(jié)果如下:
　　1.miRNAs表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)miR-12

3、75在豬卵泡閉鎖過程中表達(dá)極顯著上調(diào)(P＜0.01)，說明miR-1275可能參與了豬卵泡閉鎖的調(diào)控。流式細(xì)胞技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-1275 mimics后豬卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡率極顯著升高(P＜0.01)。放射免疫測定技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-1275 mimics后豬卵泡顆粒細(xì)胞中雌二醇含量顯著降低(P＜0.05)，Real-time PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-1275 mimics后豬卵泡顆粒細(xì)胞中雌激素生

4、成通路關(guān)鍵酶CYP19A1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平極顯著下調(diào)(P＜0.01)，CYP11A1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05)。研究結(jié)果表明miR-1275可促進(jìn)豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖，抑制CYP19A1和CYP11A1基因轉(zhuǎn)錄以及雌激素生成。
　　2.生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)CYP19A1和CYP11A1不是miR-1275的靶基因，NR5A2是miR-1275的候選靶基因。構(gòu)建NR5A2-3'UTR熒光素酶報告載

5、體，然后與miR-1275mimics共轉(zhuǎn)293細(xì)胞，熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)報告基因的活性極顯著下降(P＜0.01)，說明NR5A2是miR-1275的一個靶基因。Real-time PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-1275mimics后，豬卵泡顆粒細(xì)胞中NR5A2基因mRNA和蛋白的表達(dá)量極顯著下降(P＜0.01)。NR5A2超表達(dá)后豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡率顯著下降(P＜0.05)，而雌二醇含量則顯著上升(P＜0.05)

6、，說明NR5A2可促進(jìn)豬卵泡顆粒細(xì)胞中雌激素生成，抑制豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果表明在豬卵泡顆粒細(xì)胞中，NR5A2是miR-1275的一個靶基因，miR-1275主要通過與NR5A2基因mRNA的3'UTR相結(jié)合，降解NR5A2基因mRNA，抑制雌激素生成，從而促進(jìn)豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。
　　3.Real-time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)NR5A2超表達(dá)后豬卵泡顆粒細(xì)胞中CYP19A1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平極