Cyclin G2調控雌激素介導的細胞成骨分化作用及其分子機制研究.pdf

1、隨著全世界范圍內老齡化問題的加劇，骨質疏松癥正成為全世界各國越來越關注的重要問題。絕經后骨質疏松癥的發(fā)病機制較為復雜，絕經后卵巢功能衰竭所致雌激素驟減是目前公認的絕經后骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展的重要原因。雌激素通過雌激素受體依賴途徑調控間充質干細胞向成骨方向分化、抑制脂肪細胞形成、調控骨重建的平衡，但具體作用信號途徑和機理至今尚未完全清楚。
　　 雌激素受體途徑是雌激素發(fā)揮作用的重要通路，雌激素與雌激素受體結合并轉運入細胞核，激活啟動

2、子區(qū)域包含雌激素感應元件(estrogenre responseelements，EREs)的靶基因，相應基因表達并執(zhí)行包括調控成骨分化在內的細胞生物學功能。周期素G2(Cyclin G2)基因的啟動子區(qū)域包含1/2 EREs位點，能夠與雌激素及雌激素受體復合物結合并抑制其mRNA轉錄和蛋白表達，提示Cyclin G2可能參與了雌激素調控的某些生物學功能。Cyclin G2是一種非經典的細胞周期素(cyclin)，具有抑制細胞周期及細胞

3、增殖的作用。本課題組發(fā)現(xiàn)Cyclin G2能夠抑制腫瘤細胞的克隆形成能力，并進一步研究證實Cyclin G2能夠在腫瘤細胞中抑制經典Wnt信號通路活性(Wnt/β-catenin Signaling pathway)。
　　 經典Wnt信號通路在生物的進化過程中極為保守，在細胞增殖、分化及胚胎的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調控作用。細胞外的Wnt信號分子結合到細胞膜上特異性受體Frizzled蛋白，使胞內的Dishevelled蛋白

4、被激活，抑制糖原合成激酶-3β（glycogen syntheses kinase-3β，GSK-3β）磷酸化β-catenin的能力，導致β-catenin不能進入泛素化途徑降解。β-catenin在細胞漿中持續(xù)累積增多到一定水平后，轉移入細胞核內，與T細胞因子/淋巴增強因子(T-cell factor/lymphoidenhancer factor，TCF/LEF)家族結合并激活β-catenin靶基因的啟動子，從而激活CCND1、

5、C-MYC和RUNX2等經典Wnt信號通路的下游靶基因，進一步發(fā)揮相應的生物學效應。
　　 近年來，有研究發(fā)現(xiàn)Cyclin G2能夠通過與過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(proliferator-activated receptorγ，PPAR-γ)結合，啟動下游細胞成脂分化相關信號分子表達促進細胞的成脂分化，提示Cyclin G2可能參與細胞成骨的調控過程。另外，經典Wnt信號通路對成骨和成脂的雙重調節(jié)與絕經后骨質疏松癥的骨量減

6、少而脂肪含量明顯升高的現(xiàn)象相一致，表明該信號通路可能在絕經后骨質疏松癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，但目前對雌激素與經典Wnt信號通路之間的聯(lián)系、二者是否協(xié)同作用于細胞成骨分化的調控及絕經后骨質疏松癥的發(fā)生發(fā)展尚有待進一步證實。
　　 本研究擬在發(fā)現(xiàn)Cyclin G2抑制經典Wnt信號通路的基礎上，進一步研究Cyclin G2調控經典Wnt信號通路的作用及分子機制;以具有成骨分化能力的C2C12細胞為研究對象，檢測Cyclin G

7、2對細胞成骨分化的調節(jié)作用并闡明其分子機制;深入分析和驗證Cyclin G2對經典Wnt信號通路的調控在雌激素調節(jié)細胞成骨分化過程中扮演的角色，豐富細胞周期及細胞分化調控理論，為研究絕經后骨質疏松癥的發(fā)生發(fā)展與防治提供理論基礎。
　　 實驗材料和方法:
　　 1、成骨條件培養(yǎng)液和雌激素誘導細胞成骨分化過程中，CyclinG2的表達分析
　　 應用成骨條件培養(yǎng)液添加不同濃度的雌激素誘導C2C12細胞成骨分化，分別誘

8、導48 h提取細胞總RNA和總蛋白，通過RT-PCR和Western blot方法檢測周期素G2的內源表達水平改變;誘導7d裂解細胞，通過ALP活性測定試劑盒檢測細胞ALP活性變化;誘導14 d經無水乙醇固定細胞，應用茜素紅染色方法，檢測細胞鈣鹽沉積能力變化。
　　 2、成骨條件培養(yǎng)液、雌激素及Cyclin G2對細胞增殖的影響
　　 分別應用成骨條件培養(yǎng)液添加不同濃度雌激素誘導C2C12細胞成骨分化或通過基因轉染在細胞

9、中過表達Cyclin G2，加藥或轉染的第0h、24 h、48 h和72h，采用CCK8方法檢測C2C12細胞增殖情況，繪制生長曲線，分析成骨條件培養(yǎng)液、雌激素對細胞增殖的影響是否依賴于Cyclin G2的作用。
　　 3、Cyclin G2過表達對細胞成骨分化能力影響的研究
　　 在C2C12細胞中通過基因轉染或逆轉錄病毒感染，使細胞過表達CyclinG2。通過成骨條件培養(yǎng)液誘導細胞成骨分化，轉染后48 h提取細胞總R

10、NA，檢測細胞成骨分化標志(marker)基因表達水平改變;誘導7d裂解細胞，檢測細胞ALP活性變化;誘導14 d經無水乙醇固定細胞，經茜素紅染色檢測細胞鈣鹽沉積能力差異。
　　 4、經典Wnt信號通路在Cyclin G2調控細胞成骨分化過程中的作用分析
　　 在C2C12細胞中過表達Cyclin G2，通過RT-PCR半定量方法和Western blot方法，檢測C2C12細胞對β-catenin及其下游靶基因Runx

11、2表達的影響，通過基因轉染和逆轉錄病毒感染的方法在C2C12細胞中過表達Cyclin G2，應用LiCl激活細胞中經典Wnt信號通路活性，進一步選取特定時間點檢測細胞成骨分化marker基因表達水平、ALP活性以及鈣鹽沉積能力，分析經典Wnt信號通路在Cyclin G2調節(jié)細胞成骨分化過程中的作用。
　　 5、Cyclin G2負性調控經典Wnt信號通路參與雌激素調節(jié)細胞成骨分化的研究
　　 通過基因轉染或逆轉錄病毒感染

12、在C2C12細胞中過表達Cyclin G2，添加雌激素誘導細胞成骨分化，感染48 h提取細胞總RNA和總蛋白，通過RT-PCR和Western blot方法檢測成骨marker基因的內源表達水平改變;誘導7d裂解細胞，通過ALP活性測定試劑盒檢測細胞ALP活性變化;誘導14 d經無水乙醇固定細胞，應用茜素紅染色方法，檢測細胞鈣鹽沉積能力變化。
　　 6、Cyclin G2調節(jié)經典Wnt信號通路活性的作用靶點及分子機制研究

13、　　 應用不同劑量的包裝Cyclin G2基因（CCNG2）的逆轉錄病毒感染COS-7細胞，48 h后提取細胞總蛋白，Western blot檢測Cyclin G2對GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及其下游靶基因的影響;在COS-7細胞中過表達Cyclin G2，應用LiCl(40 mM)抑制GSK-3β活性，檢測LiCl對Cyclin G2調節(jié)β-catenin及其下游靶基因能力的影響，分析Cyclin G2調控經

14、典Wnt信號通路是否需要GSK-3β的活性;通過RNA干擾方法抑制COS-7細胞中內源Dpr1表達，Western blot方法檢測Dpr1表達抑制對Cyclin G2負調控β-catenin及其下游靶基因的影響，明確Cyclin G2負性調控經典Wnt信號通路的作用靶點;在COS-7細胞中過表達Cyclin G2或干擾內源Cyclin G2表達水平，Western blot方法檢測Cyclin G2對Dvl-2蛋白的影響;并通過抑制劑

15、特異性抑制相應蛋白降解途徑，Western blot方法檢測Cyclin G2下調Dvl-2蛋白表達作用的改變，明確Cyclin G2負性調控經典Wnt信號通路的級聯(lián)信號分子機制。
　　 實驗結果:
　　 1、Cyclin G2在體外參與雌激素誘導細胞成骨分化的過程
　　 通過RT-PCR半定量、Western blot及細胞成骨相關檢測方法，檢測成骨條件培養(yǎng)液與雌激素對細胞成骨分化及Cyclin G2表達的影響

16、，發(fā)現(xiàn)二者在上調C2C12細胞成骨標志（marker）基因(Runx2，Oc，Col Ia和ALP)表達、細胞ALP活性(P＜0.001)和鈣鹽沉積能力的同時，能夠引起Cyclin G2的表達mRNA和蛋白表達水平下調，且該下調作用與雌激素劑量和細胞成骨分化水平呈正相關。
　　 2、雌激素對細胞成骨能力的調節(jié)不依賴于Cyclin G2對細胞增殖的影響
　　 通過CCK8方法選取相同時間點檢測成骨條件培養(yǎng)液、雌激素以及過表

17、達Cyclin G2對C2C12細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)成骨條件培養(yǎng)液和Cyclin G2能夠顯著抑制細胞增殖能力。添加雌激素對C2C12無明顯調節(jié)作用，表明成骨條件培養(yǎng)液和雌激素對細胞成骨分化水平與Cyclin G2抑制細胞增殖的作用無關。
　　 3、Cyclin G2負性調控細胞成骨分化能力
　　 在C2C12細胞中通過基因轉染或逆轉錄病毒感染，使細胞中Cyclin G2過表達。通過成骨條件培養(yǎng)液誘導細胞成骨分化，發(fā)現(xiàn)C

18、yclin G2過表達在C2C12細胞中能夠下調細胞成骨分化marker基因表達水平、ALP活性(P＜0.05)以及鈣鹽沉積能力，表明Cyclin G2具有抑制細胞體外成骨分化能力的作用。
　　 4、Cyclin G2通過經典Wnt信號通路負性調控細胞成骨分化能力
　　 在C2C12細胞中過表達Cyclin G2，通過RT-PCR半定量方法和Western blot方法檢測C2C12細胞對β-catenin及其下游靶基因

19、Runx2表達的影響，發(fā)現(xiàn)Cyclin G2對β-catenin和Runx2的表達具有明顯的下調作用，提示Cyclin G2可能通過經典Wnt信號通路調節(jié)細胞成骨分化能力。應用LiCl激活細胞中經典Wnt信號通路活性，進一步檢測細胞成骨分化marker基因表達水平、ALP活性以及鈣鹽沉積能力，發(fā)現(xiàn)Cyclin G2過表達抑制細胞成骨分化的能力被LiCl抑制，表明Cyclin G2通過經典Wnt信號通路負性調控細胞成骨分化能力。
　

20、　 5、Cyclin G2抑制雌激素對細胞成骨分化的上調能力
　　 應用雌激素誘導過表達Cyclin G2的C2C12細胞成骨分化，通過成骨相關檢測方法檢測細胞成骨分化水平，發(fā)現(xiàn)雌激素上調細胞成骨分化水平的能力被過表達Cyclin G2明顯抑制，表明Cyclin G2是雌激素在體外調節(jié)細胞成骨分化能力的重要因子。
　　 6、Cyclin G2調控經典Wnt信號通路的作用靶點和分子機制
　　 應用不同劑量的包裝C

21、yclin G2基因的逆轉錄病毒感染COS-7細胞，檢測Cyclin G2對β-catenin及其下游靶基因的影響，發(fā)現(xiàn)Cyclin G2對抑制β-catenin及其下游靶基因的作用與Cyclin G2表達呈正相關;檢測Cyclin G2對p-GSK-3β表達的影響;應用LiCl抑制GSK-3β活性，發(fā)現(xiàn)Cyclin G2抑制p-GSK-3β表達，而LiCl能夠干擾Cyclin G2調節(jié)β-catenin及其下游靶基因的能力，表明該作用

22、依賴GSK-3β的活性;通過RNA干擾方法抑制COS-7細胞中內源Dpr1表達，Western blot方法檢測Cyclin G2對β-catenin及其下游靶基因的影響，發(fā)現(xiàn)Dpr1表達水平降低引起Cyclin G2負性調控β-catenin及其下游靶基因的作用受到抑制，表明Dpr1是Cyclin G2負性調控經典Wnt信號通路的作用靶點;在COS-7細胞中過表達Cyclin G2或干擾內源Cyclin G2表達水平，Western

23、blot方法檢測Cyclin G2對Dvl-2蛋白的影響，明確內源和外源Cyclin G2均具有抑制Dvl-2蛋白表達的作用;通過抑制劑特異性抑制相應蛋白降解途徑，Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)Cyclin G2下調Dvl-2蛋白表達的作用被MG-132抑制，表明Cyclin G2促進Dvl-2蛋白經泛素化途徑降解。
　　 結論:
　　 1、Cyclin G2介導經典Wnt信號通路負性調控細胞的成骨分化能力。