雞等級(jí)前卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)育的激素和營養(yǎng)調(diào)控及機(jī)理研究.pdf

1、家禽卵巢是研究卵巢生物學(xué)和卵泡發(fā)育的理想模型,而卵泡顆粒細(xì)胞因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其在卵泡發(fā)育中的重要作用,常被看作卵泡發(fā)育的一個(gè)重要標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)通過小黃卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,探討了家禽生產(chǎn)中重要的生殖激素、生長因子及與卵泡發(fā)育相關(guān)的營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)顆粒細(xì)胞生長發(fā)育和功能的影響及作用機(jī)理,以期為家禽優(yōu)勢(shì)卵泡選擇及繁殖性能的提高提供理論依據(jù)。
　　 1.等級(jí)前小黃卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立和應(yīng)用
　　 采用機(jī)械法和膠原酶法

2、分散成年產(chǎn)蛋雞等級(jí)前小黃卵泡顆粒層,添加不同濃度的血清培養(yǎng)顆粒細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后用四甲偶氮唑藍(lán)比色法測(cè)定其活性。結(jié)果表明在添加0.5％胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)16h后換成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),同時(shí)用藥物處理細(xì)胞,這一培養(yǎng)模型能較好地維持顆粒細(xì)胞的存活和增殖。此外,本實(shí)驗(yàn)中選用對(duì)卵泡發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用的卵泡刺激素(FSH)驗(yàn)證培養(yǎng)模型的可行性。0.1～10 ng/ml的FSH對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖作用呈顯著的劑量一效應(yīng)關(guān)系。FS

3、H對(duì)小黃卵泡顆粒細(xì)胞促增殖作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究表明:通過添加PKA、PKC信號(hào)途徑激活劑(forskolin、PMA)及其相應(yīng)的抑制劑(H89、H7),發(fā)現(xiàn)PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在FSH的促小黃卵泡顆粒細(xì)胞增殖過程中起主導(dǎo)作用。細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定結(jié)果與上述結(jié)果呈相同趨勢(shì)。以上結(jié)果表明所建立的雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)模型是一種評(píng)價(jià)外源性激素離體生物效應(yīng)的簡(jiǎn)易、快速和準(zhǔn)確并且易于觀察的良好模型。
　　 2.前列

4、腺素對(duì)顆粒細(xì)胞的促增殖作用及其機(jī)理研究
　　 本實(shí)驗(yàn)探討了前列腺素PGE1對(duì)雞等級(jí)前小黃卵泡顆粒細(xì)胞增殖的作用及其作用途徑。顆粒細(xì)胞在低濃度血清(0.5％FCS)中預(yù)培養(yǎng)16h后換成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),同時(shí)單獨(dú)添加前列腺素PGE1(0.1～100 ng/ml)或FSH(10 ng/ml)處理24h。當(dāng)PGE1濃度在0.1～10 ng/ml范圍時(shí),顆粒細(xì)胞的增殖作用呈上升趨勢(shì),當(dāng)濃度達(dá)到100 ng/ml時(shí),其作用呈下降趨勢(shì)

5、,其中PGE110 ng/ml的作用效果最明顯,且其作用效果類似與FSH。PG作用機(jī)理研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)前列腺素受體阻斷劑SC19220(10-7～10-5 mol/l)分別與P3H和PGE1聯(lián)合處理后,FSH和PGE1的促增值作用均被顯著抑制,且呈劑量效應(yīng);前列腺素合成酶阻斷劑消炎痛(10-7～10-5 mol/l)與FSH聯(lián)合后,FSH對(duì)顆粒細(xì)胞的促增殖作用也呈劑量效應(yīng)被抑制。PGE1對(duì)小黃卵泡顆粒細(xì)胞促增殖作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究表明:

6、通過添加PKA、PKC信號(hào)途徑激活劑(forskolin、PMA)及其相應(yīng)的抑制劑(H89、H7),發(fā)現(xiàn)PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在PGE1的促小黃卵泡顆粒細(xì)胞增殖過程中起作用。PCNA測(cè)定結(jié)果與上述結(jié)果呈相同趨勢(shì)。轉(zhuǎn)錄因子CREB1免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PGE1可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞內(nèi)CREB1的表達(dá),但其表達(dá)強(qiáng)度較forskolin處理組弱。上述結(jié)果表明PGE1具有類似于FSH的生理作用,可促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖。小黃卵泡顆粒細(xì)胞上存在PGE受體,F

7、SH可以促進(jìn)小黃卵泡顆粒細(xì)胞合成PGE1,PGE1可通過FSH介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)促進(jìn)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CREB1的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖。
　　 3.前列腺素和表皮生長因子的互作對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)探討了前列腺素PGE1和表皮生長因子(EGF)間的相互作用對(duì)產(chǎn)蛋雞等級(jí)前小黃卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響。用12.5μg/ml的膠原酶將顆粒層分散為單個(gè)顆粒細(xì)胞,在低濃度血清(0.5％FCS)中預(yù)培養(yǎng)16h

8、后換成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),同時(shí)用藥物處理細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明小黃卵泡顆粒細(xì)胞表達(dá)EGF及其受體EGFR,而且這種表達(dá)能被PGE1(1～100 ng/ml)和forskolin(10-7～10-5 mol/l)處理所增強(qiáng)。EGFR的表達(dá)同樣也能被其配體EGF所增強(qiáng)。選擇性環(huán)氧合酶(COX)抑制劑SC560(10p7～10-5mol/l,特異性抑制COX-1)和NS398(10-7～10-5 mol/l,特異性抑制COX-2

9、)抑制了EGF誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞的增殖,EGF的這種作用被PCNA免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果證實(shí)。盡管EGF促進(jìn)了顆粒細(xì)胞內(nèi)COX-1和COX-2的表達(dá),但是EGF與特異性的PG合成酶抑制劑聯(lián)合后再添加PGE1的補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PGE1對(duì)NS398抑制的EGF誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞的增殖的補(bǔ)救效果較SC560明顯。這表明COX-2在介導(dǎo)EGF作用的過程中占主導(dǎo)地位。上述結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)PG和EGF相互促進(jìn)合成的作用增強(qiáng)了顆粒細(xì)胞的增殖作用,進(jìn)而促進(jìn)了等級(jí)前卵

10、泡的發(fā)育。
　　 4.花生四烯酸對(duì)顆粒細(xì)胞增殖、活性及功能的影響
　　 花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是一類順式多不飽和脂肪酸,是動(dòng)物細(xì)胞膜磷脂的重要組成部分。除了作為前列腺素合成的前體物調(diào)節(jié)動(dòng)物生殖過程外,花生四烯酸在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的過程中也起重要作用。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用低濃度血清顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)模型探討了花生四烯酸對(duì)產(chǎn)蛋雞等級(jí)前小黃卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)育及功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的花生四烯酸、亞油酸和亞麻酸(1

11、0-7～10-4 mol/l)對(duì)顆粒細(xì)胞沒有明顯的促增殖作用。四甲偶氮唑藍(lán)比色法測(cè)定細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn),花生四烯酸(10-6～10-5 mol/l)可以增強(qiáng)細(xì)胞的活性,但當(dāng)花生四烯酸達(dá)10-4 mol/l時(shí),細(xì)胞活性下降。PKA、PKC免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),花生四烯酸主要通過PKC信號(hào)途徑發(fā)揮作用。此外,花生四烯酸對(duì)顆粒細(xì)胞功能的研究發(fā)現(xiàn),花生四烯酸(10-7～10-5 mol/l)能夠增加細(xì)胞外基質(zhì)成分層粘連蛋白(laminin,LN)

12、和縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)。上述結(jié)果表明花生四烯酸通過PKC信號(hào)通路增強(qiáng)了細(xì)胞活性,并通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間縫隙連接蛋白的合成調(diào)控細(xì)胞的功能。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:顆粒細(xì)胞在0.5FCS％中預(yù)培養(yǎng)16h后換成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),同時(shí)用藥物處理細(xì)胞的模型,能夠用于研究顆粒細(xì)胞的增殖、分化、形態(tài)變化以及這種專一性細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,并可用于研究與卵泡結(jié)構(gòu)、功能、生長及成熟相關(guān)的影響因素的作用及機(jī)理。在此模型上發(fā)現(xiàn),P

13、GE1通過FSH介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)促進(jìn)EGF、EGFR及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CREB1的表達(dá);而EGF主要通過促進(jìn)COX-2的表達(dá)增加了PG的合成,它們形成了一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的正反饋循環(huán)通路,并通過不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交聯(lián),加速了小黃卵泡顆粒細(xì)胞的增殖,從而促進(jìn)了等級(jí)前卵泡的發(fā)育。而AA通過PKC信號(hào)通路,影響顆粒細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞間縫隙連接蛋白的表達(dá),從而影響顆粒細(xì)胞的功能。因此,AA及其代謝物PG可通過改變小黃卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和分化