酶譜法檢測血清基質金屬蛋白酶mmpmmp的活性

1、蛋白質高級結構的預測酶譜法檢測血清中基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活性食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性變化及其臨床意義,綜合性設計性實驗-2,,此實驗共包括如下三個部分第一部分，蛋白質高級結構的預測第二部分，酶譜法檢測血清中基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性第三部分，食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性變化及其臨床意義,第一部分，蛋白質高級結構的預測,蛋白質的三維構象，也稱空間結構或高級結構，

2、是指蛋白質分子中原子和基團在三維空間上的排列、分布及肽鏈的走向。高級結構是蛋白質表現(xiàn)其生物功能或活性所必須的。X射線晶體學方法是至今為止研究蛋白質結構最有效的方法，所能達到的精度是任何其他方法所不能比擬的，它的缺點是蛋白質的晶體難以培養(yǎng)，晶體結構測定的周期較長。近年發(fā)展起來的多維核磁共振方法可以直接測定蛋白質在溶液中的構象，但是由于對樣品的需要量大、純度要求高，被測定的蛋白質的分子量一般不超過20000 Da等原因，也受到很大限制。

3、,截至2019年6月，與迅速增長的龐大基因組核酸數(shù)據相反，已知三級結構的蛋白數(shù)量還不到6萬個。（來自蛋白結構數(shù)據PDB的統(tǒng)計）,利用蛋白質的一級結構所提供的氨基酸序列信息來進行高級結構預測的方法就是應這種需要而發(fā)展起來的。蛋白質的一級結構決定高級結構這一論點，仍然是進行蛋白質三級結構預測的理論基礎。目前蛋白質三級結構預測的方法有： （1）在已知結構（如晶體結構）的基礎上利用分子動力學方法研究蛋白質分子、 核酸分子或復合物

4、的動態(tài)性質。 （2）利用能量優(yōu)化或分子動力學方法對結構模型進行優(yōu)化；或者是在整體結構已知的情況下建立點突變體的結構。 （3）借助于類似物的結構參數(shù)建立未知蛋白質的結構。 （4）結合2D-NMR數(shù)據或X-RAY粗結構數(shù)據或其他的實驗數(shù)據建立蛋白質的整體模型結構模型。,（5）在上述條件均不符合的情況下，根據一級結構進行二級結構預測，準確度＜65％。（6）在已知二級結構的基礎上進行片段堆積，根據從已知結構得出的一

5、些規(guī)則進行篩選，挑選可能的結構，往往得到多種可能性，尚不能得到唯一的正確堆積方式。（7）在單體結構已知的情況下，建立復合物或多聚體的結構，參考復合物或聚合物本 身的性質，利用幾何匹配和最大接觸面積規(guī)則進行。,從待測蛋白質序列出發(fā)，搜索蛋白質結構數(shù)據庫（如PDB,SWISS-PROT等），得到許多相似序列（同源序列），選定其中一個（或幾個）作為待測蛋白質序列的模板；待測蛋白質序列與選定的模板進行再次比對，插入各種可能的空位使兩者的保守

6、位置盡量對齊；建模：調整待測蛋白序列中主鏈各個原子的位置，產生與模板相同或相似的空間結構，待測蛋白質空間結構模型；利用能量最小化原理，使待測蛋白質側鏈基團處于能量最小的位置。,同源建模法預測蛋白質三級結構一般由四步完成：,SWISS-MODEL 蛋白質結構預測,SWISS-MODEL利用同源建模的方法實現(xiàn)對一段未知序列的三級結構的預測。該服務創(chuàng)建于1993年，開創(chuàng)了自動建模的先河，并且它是訖今為止應用最廣泛的免費服務之一。swiss

7、model.expasy.org//SWISS-MODEL.html,,First Approach mode(簡捷模式）這種模式提供一個簡捷的用戶介面：用戶只需要輸入一條氨基酸序列，服務器就會自動選擇合適的模板。如果一條模板與提交的目標序列相似度大于25%，建模程序就會自動開始運行，結果以Email形式返回。,常用觀看蛋白三級結構的軟件,RasMol,WPDB,Cn3D,第二部分，酶譜法檢測血清中基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9

8、的活性,常見電泳技術,按支持介質的不同可分為：紙電泳（Paper electrophorisis）醋酸纖維薄膜電泳（Cellulose Acetate electrophoresis）瓊脂凝膠電泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel-electrophoresis） SDS-聚丙烯酰

9、胺凝膠電泳（SDS-PAGE,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）按支持介質形狀不同可它為： 薄層電泳 板電泳 柱電泳,電泳設備,垂直電泳系統(tǒng),水平電泳系統(tǒng),聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N′-甲叉雙丙烯酰胺(N,N ′ -methylene-bisacylamide,簡稱Bis)在加速劑 N,N,N,N-四甲基乙二

10、胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，簡稱AP) 的作用下聚合交聯(lián)成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。,N,N′-甲叉（亞甲基）雙丙烯酰胺,丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺凝膠有下列特

11、性：在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，在很多溶劑中不溶；對pH和溫度變化較穩(wěn)定；幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好；樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g；凝膠孔徑可調節(jié)，根據被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調節(jié)凝膠的孔徑；分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄

12、膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。,SDS－PAGE的原理,聚丙烯酰胺凝膠電泳是網狀結構，具有分子篩效應，蛋白質在電泳中保持完整的狀態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。而SDS-PAGE僅根據蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個技術首先是1967年由shapiro建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。SDS（Sodiu

13、m Dodecyl Sulfate）是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的蛋白量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。因此在電泳時，蛋白質分子的遷移速度則

14、主要取決于蛋白質分子大小。,不同分子量的蛋白質在凝膠中運動示意圖,不同聚丙烯酰胺凝膠濃度對不同分子量的蛋白質混合物分離能力的關系,腫瘤細胞的侵襲移動,腫瘤細胞侵襲是指腫瘤細胞粘附并穿越細胞外基質，包括三個重要的步驟：粘附于基膜，裂解基膜蛋白形成缺口，細胞經缺口移動。腫瘤細胞對周圍組織和血管的侵襲是腫瘤細胞轉移的關鍵步驟。轉移的腫瘤細胞在原灶外存活和增殖，這是癌癥對人類生命的最大威脅。,細胞間基質結構示意圖,細胞外基質(extrac

15、ellular matrix，ECM)主要成份由膠原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖組成。ECM在上皮或內皮細胞的基底部，即以基底膜(basement membranes，BM)的形式存在，在細胞間結構以間質結締組織(interstitial connective tissue)形式存在。膠原是ECM的主要成分，目前已發(fā)現(xiàn)，至少有12種不同膠原類型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ型膠原是間質結締組織中的主要成分。Ⅳ型膠原則主要存在于基底膜內。,腫瘤

16、細胞的侵襲是需要與細胞增殖、分化、移動的相關基因及其表達調控模式的改變和促進細胞移動的外界因素兩者的共同作用。雖然腫瘤細胞侵襲的分子機制還不是十分清楚，但已發(fā)現(xiàn)許多調控細胞侵襲轉移的關鍵分子及其信號通路。腫瘤細胞通過其表面受體與ECM中的各種成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶類來降解基質，從而形成局部溶解區(qū)，構成了腫瘤細胞轉移運行通道。一般惡性程度高的腫瘤細胞具有較強的蛋白水解作用，可侵蝕破壞包膜，促進轉移。目前較為關注的酶主要是絲氨酸

17、蛋白酶類，如纖溶酶原激活物(plasminogen activator, PA)和金屬蛋白酶(metalproteinase, MMP)類，如膠原酶IV、基質降解酶、透明質酸酶。,MMPs家族成員根據其在細胞中表達部位的不同，分為胞質型和膜型兩大類。前者分布在胞質中，后者表達在膜上。胞質型MMPs根據其作用底物的特異性、敏感性及氨基酸序列的同源性分為三大類： （1）間質膠原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-1

18、3，其作用底物主要為間質膠原, 即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型膠原, 但不能降解明膠和Ⅳ型膠原； （2）明膠酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型膠原和明膠，還可降解Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型膠原,但不能降解間質膠原； （3）間充質溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是基質中的蛋白多糖和糖蛋白，如纖維粘連蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)，間充質溶解素對膠原的作用不同于間質膠原酶

19、和明膠酶，它們能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型膠原酶以及Ⅰ型膠原的氨基端。通過影響細胞外基質，基質金屬蛋白酶蛋白家族參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經等許多疾病過程。,基質金屬蛋白酶蛋白家族,MMP-2又叫明膠酶A， 其蛋白主要由纖維結締組織細胞和腫瘤細胞產生，分子量為72kDa。MMP-9又稱為明膠酶B，主要由單核細胞、巨噬細胞多形核白細胞和腫瘤細胞產生。分子量為92kDa，是MMPs中分子量最大的酶。

20、中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是1993年Kjeldsen等人在研究MMP-9在細胞內存在形式時發(fā)現(xiàn)的，它能夠與MMP-9聚合形成異源二聚體，保護和調節(jié)MMP-9活性，從而促進惡變細胞的浸潤和轉移。檢測MMP-9和MMP-2的活性，對分析腫瘤細胞惡性程度和預后提供幫助。,由N 端的310螺旋、C 端的α螺旋和中間的和中間的八段反平行的β折疊

21、所構成，這八段反平行式β折疊構成了一個β折疊桶結構。此β折疊桶結構一端是開放的，為與配體結合提供了進口；而另一端則被短的N 端310螺旋所封閉。在β折疊桶底部內側排列著疏水的芳香族和脂肪族氨基酸殘基，形成了一個疏水核或疏水內部，為結合親脂性配體提供了位點。,NGAL的三級結構,MMP-2的結構,Pre: 信號肽序列Pro: 帶巰基的前肽Zn: Zn離子結合部分II: 能結合膠原的II型纖維結合素結構域H: 絞鏈區(qū)H

22、emopexin：類血紅素蛋白結構，由四段重復序列組成，其中第一個與第四個間存在一 個二硫鍵。,MMP-9的結構,由三個α螺旋與5個β折疊構成含有2個鋅離子和5個鈣離子右圖可見一個小分子化合物位于酶活性中心，并與一個鋅離子結合,NGAL能與MMP-9以二硫鍵的方式結合，能起到保護和調節(jié)MMP-9功能的作用，所以NGAL與腫瘤的侵襲移動有密切的聯(lián)系。汕頭大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室李恩民教授課題組以轉染有pcDNA3 空白

23、質粒載體的SHEEC 細胞為對照，酶譜法檢測結果表明，轉染有pcDNA-NGAL (-) 的SHEEC 細胞分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明顯降低；而與此同時，轉染有pcDNA-NGAL (＋) 的SHEEC 細胞分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明顯升高。表明通過有義、反義技術使NGAL 基因表達發(fā)生改變可以對SHEEC 細胞分泌的MMP-9 和MMP-2 的活性產生明顯影響。,M：蛋白marker；1. 細胞培養(yǎng)基；2.

24、 pcDNA3；3. pcDNA-NGAL ( + )；4. pcDNA-NGAL ( - ),MMP-2和MMP-9活性的強弱與腫瘤浸潤和轉移的能力密切相關。明膠是這兩種酶的底物。所以在體外通過酶譜法（Zymography）檢測樣品（組織，細胞培養(yǎng)液，血清，血漿，尿）中MMP-2和MMP-9的活性，對了解腫瘤細胞的惡性程度、監(jiān)測治療效果和評價預后具有重要的指導意義。酶譜法的基本過程是先將樣品進行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，

25、含0.1％明膠）電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍將凝膠染色，再脫色，在藍色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。,實驗原理,實驗操作,樣品制備: 血清、血漿和尿樣品可取適量直接與2×SDS 樣品緩沖液等體積混勻進行下一步實驗，如酶活性太高造成顯帶不理想，可適當進行稀釋;凝膠的制備: 玻璃板對

26、齊后放入夾中垂直卡緊。按表格配10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，灌膠時，可用5ml加樣槍吸取凝膠沿玻璃板加進去，然后膠上加一層異丙醇，以隔離空氣中的氧，促進凝膠聚合（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時凝膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡）。約幾分鐘后當異丙醇和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了，再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。按前面表格配4％的濃縮膠，加入TEMED

27、后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出;,在每個加樣孔中加入10 µl樣品;電泳： 在4℃ 100V下，約2h;凝膠的處理： （1）電泳結束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液在室溫搖動下洗滌1h，其間換液一次； （2）棄去洗滌緩沖液，然后加入

28、孵育緩沖液沒過膠面，至37℃恒溫箱中，24h后取出； （3）棄去孵育緩沖液，加入0.1%考馬斯亮藍染液染色約30min，回收染液，加入脫色液脫色至藍色背景和白色條帶均十分明顯時，用5％乙酸中止脫色； （4）待凝膠在5％乙酸中恢復到適當大小后，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結果，以白色條帶的凈光密度值相對定量樣品中酶活性。,預期實驗結果,第三部分，食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性變化及其臨床意義,癌癥的發(fā)生發(fā)展

29、是多基因多因素參與的慢性長期過程。癌組織的發(fā)生發(fā)展有著由單純增生→不典型增生→原位癌→浸潤癌演變過程的連續(xù)性。 癌癥分期大別分為四期： 第一期：腫瘤局限一處，沒有擴散跡象； 第二期：腫瘤已擴散到鄰近的淋巴結，但沒有波及其它器官或組織； 第三期：腫瘤除了擴散到鄰近淋巴結外，還波及附近器官或組織； 第四期：腫瘤已擴散到遠處的部位；一般言之，第一、二期屬早期，治療后痊愈機會高；第三、四期屬晚期，治愈及存